12 Диссертация Смолянова

21

Рисунок 1.3 – Коэффициент корреляции по Спирмену между коммерческими серологическими тестами и результатами в РВН. Для проведения РВН использовали Набор

GenScript Surrogate Virus Neutralization Test Kit (кат. № L00847). Использовали следующие ИФА тест-системы: GA_S (определение антител класса IgG к S белку SARS-CoV-2), GA_S2 (определение антител класса IgG к S2 белку SARS-CoV-2), GA_NC (определение антител класса IgG к N белку SARS-CoV-2) (Производитель Generic Assay, Германия), Diapro_IgG (определение антител класса IgG к S и N белкам SARS-CoV-2), Diapro_IgA (определение антител класса IgА к S и N белкам SARS-CoV-2), Diapro_IgM (определение антител класса IgМ к S и N белкам SARS-CoV-2), (Производитель Dia.Pro, Италия), Евроиммун_IgG (определение антител класса IgG к S1 домену S белка SARS-CoV-2), Евроиммун_IgA (определение антител класса IgА к S1 домену S белка SARS-CoV-2), (Производитель Евроиммун, Германия), Микроген_IgG (определение антител класса IgG к N белку SARS-CoV-2), (Производитель Mikrogen, Германия), Vircell_IgG (определение антител класса IgG к S и N белкам SARS-CoV- 2), Vircell_IgAM (определение антител класса IgА и IgМ к S и N белкам SARS-CoV-2), (Производитель Vircell, Испания), GenScript_RBD (определение антител класса IgG к RBD домену S белка SARS-CoV-2), (Производитель GenScript, США) [86].

Таким образом, исходя их литературных данных не только ИФА тест системы,

содержащие S белок, но и тест-системы с N белком, со смесью S и N белков, а также различные

домены S белка показывают корреляцию с результатами, полученными в РВН [86]. Однако

23

Таблица 1.1 – Номенклатура зарегистрированных в РФ лекарственных препаратов специфических иммуноглобулинов человека и животных

24

25

человека

Лекарственные препараты специфических иммуноглобулинов животных против инфекционных агентов

26

27

В результате анализа литературы установлено, что в нашей стране проводились исследования по фармацевтической разработке ЛП специфических ИГЧ для внутривенного введения против клещевого энцефалита, цитомегаловируса и вируса простого герпеса 1 и 2

типов, гриппа, коклюша [89-91]. В настоящее время указанные препараты не зарегистрированы в России. Также отсутствуют ЛП специфических ИГЧ против вирусов краснухи, гепатита А,

кори, паротита, ветряной оспы, присутствующие в обращении в некоторых других странах [51].

Иммуноглобулины, в зависимости от особенностей технологического процесса производства, различаются по составу и свойствам, например содержанию белка, целостности молекулы IgG, используемым стабилизаторам или рН. Эти факторы могут влиять на уровень активности при связывании с инфекционным агентом и, следовательно, могут изменять их терапевтическую эффективность [85].

Наряду с необходимостью расширения номенклатуры ЛП СИГ направленного действия,

важным является необходимость повышения качества выпускаемых ЛП, зависящего от исходного сырья и технологического процесса производства [92].

Международные стандарты качества на ЛП СИГ предъявляют высокие требования как вирусной, так и специфической безопасности при условии сохранения терапевтической эффективности. Считается, что иммуноглобулинотерапия достаточно эффективна, если количество введенных антител будет, по крайней мере, в 4 раза превышать микробную нагрузку или полностью восполнит имеющийся в организме дефицит антител. Специфическая активность ЛП СИГ – это характеристика, основанная на анализе его эффективности по отношению к специфическому антигену, связанная с терапевтической эффективностью препарата. В связи с этим предъявляются высокие требования к методу контроля показателя специфической активности [92].

1.4.2. Обзор методик оценки уровня специфической активности в лекарственных

препаратах иммуноглобулинов человека

Для ЛП СИГ, как противовирусных, так и антибактериальных, полученных из крови человека и животных, отечественные производители подтверждают специфическую активность следующими методами:

- в реакции нейтрализации на животных моделях: содержание специфических антител в ЛП СИГ человека и животных противостолбнячных для внутримышечного введения при определении в реакции нейтрализации столбнячного анатоксина на мышах (не менее 1200

МЕ/мл) [93]; содержание антител к вирусу бешенства в реакции нейтрализации на мышах для ЛП антирабического СИГ человека и животных [94]; содержание антител в ЛП дифтерийного

28

антитоксина при определении в реакции нейтрализации дифтерийного анатоксина на морских свинках (не менее 1500 МЕ/мл) [95]; содержание специфических антител против

C. perfringens типа A, С. Septicum, С. novyi в реакции нейтрализации на мышах для ЛП антитоксина гангренозного лошадиного [96]; содержание специфических антител против ботулинических токсинов проводят в реакции нейтрализации на мышах для ЛП антитоксинов ботулинических типов А, В и Е [97]; противоаллергическую активность в реакции пассивной системной анафилаксии на морских свинках для ЛП противоаллергического СИГ (в

соответствии с методикой предприятия) [98]; содержание антитоксина против яда гадюки исследуют также биологическим методом с применением мышей [99].

- в реакции нейтрализации на клетках или хорионаллантоисных оболочках куриных эмбрионов: содержание антител к ортопоксовирусам проводят в реакции нейтрализации на хорионаллантоисных оболочках 12-дневных куриных эмбрионов для ЛП ИГЧ противооспенных

(в соответствии с методикой предприятия) [100]; содержание антител к стафилококковому альфатоксину в реакции нейтрализации гемолитических свойств [101, 102]; нормативные требования отличаются: «не менее 20 МЕ антистафилолизина в 1 мл)»,

-в реакции диффузной преципитации: содержание специфических антител против B. Anthracis для ЛП Иммуноглобулина противосибиреязвенного лошадиного проводят в реакции диффузной преципитации с сибиреязвенным цитоплазматическим антигеном и дополнительно проводят определение превентивных свойств на морских свинках [103];

-в реакции гемагглютинации: титр антител против сальмонелл и шигелл в реакции пассивной гемагглютинации для ЛП СИГ для энтерального применения (КИП) (в соответствии

синструкциями по использованию соответствии с инструкциями коммерческих диагностикумов) [104]; титр антител против вируса клещевого энцефалита в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) для ЛП ИГЧ против клещевого энцефалита (в

соответствии с инструкциями по использованию тест-систем и наборов реагентов) должен составлять не менее 1:80 в 1 мл ЛП [105];

-иммунологическими методами: содержание антител к вирусу гепатита В методом ИФА для ЛП ИГЧ против гепатита В (в соответствии с инструкциями по использованию тест-систем и наборов реагентов) должно составлять не менее 50 МЕ/мл в 1 мл ЛП (в 1 дозе в объеме 2 мл в ампуле не менее 100 МЕ) [106, 107]; оценку специфической активности ЛП ИГЧ человека антирезус Rho(D) проводят одним из трех методов (с использованием автоматического анализатора (метод А), конкурентным ИФА (метод В) или с использованием проточного цитофлуориметра (метод С)) при условии проведения валидации методики и приемлемой корреляции результатов, полученных методом В или С, с результатами метода А [108-111]. В

нашей стране в соответствии с требованиями нормативных документаций специфическую

29

активность ЛП антирезусных ИГЧ подтверждают в реакции непрямой агглютинации, определяя титр антиRho(D) антител [112].

Таким образом, из производимых в нашей стране ЛП СИГ специфическая активность 8

наименований исследуется биологическими методами с применением лабораторных животных,

для 4 наименований используют метод РТГА и только для 2 наименований ЛП проводят оценку специфической активности методом ИФА.

1.4.3. Реакция вируснейтрализации на модели животных

Для ЛП противовирусных СИГ показатель специфическая активность характеризует уровень ВНА антител в составе препарата. Классическим методом определения ВНА иммуноглобулинов принято считать оценку титра в РВН на животных моделях [113-115].

Принцип РВН на животных моделях состоит в том, что при взаимодействии антигена

(вируса) с гомологичными антителами образуется комплекс антиген + антитело. Антитела непосредственно не повреждают патоген, однако они образовывают комплекс с патогеном,

благодаря чему, например, блокируют адгезию или пенетрацию вирусных частиц в чувствительные клетки в организме животного, в результате нейтрализуется инфекционность вируса. Если специфических антител введено в организм достаточно относительно введенной дозы вируса, то это предотвращает или обрывает развитие инфекционной болезни [116].

При постановке реакции в пробирке смешивают определенную дозу вируса и исследуемый препарат, смесь выдерживают при соответствующей температуре (4, 22 или 37 °С)

в течение определенного времени (зависит от вируса и условий опыта). Затем этой смесью заражают чувствительную к вирусу живую систему, наблюдают за состоянием живых объектов

ичерез соответствующий срок (в зависимости от вируса) учитывают результат нейтрализации вируса по отсутствию:

1)гибели, развития клинической картины болезни и патологических изменений в органах

итканях лабораторных животных

2)гибели, патологических изменений в оболочках, тканях зародыша и отсутствию гемагглютининов в жидкостях полостей куриных эмбрионов [117].

Так как для нейтрализации определенного количества вируса требуется определенное количество антител, то для определения уровня нейтрализующих антител в препарате при постановке PВH к разным дозам (разведениям) испытуемого образца (обычно в виде последовательных 2-кратных разведений) добавляют одинаковые дозы вируса.

В этом случае определяют максимальное разведение исследуемого препарата, при котором сохраняется ВНА образца, что применительно к ЛП СИГ указывает уровень нейтрализующих антител относительно стандартного образца. Необходимо помнить, что любая

30

серологическая реакция (в том числе и PВH) должна сопровождаться контролями на каждый компонент, участвующий в реакции [117].

Однако в модельном эксперименте с использованием животных антитела, содержащиеся в ЛП СИГ, не связываются посредством Fc-фрагмента с соответствующими рецепторами фагоцитов, что могло способствовать поглощению патогена, так как Fc-фрагменты видоспецифичны. Не оцениваются и другие механизмы действия иммуноглобулинов:

опсонизирующая способность, т. е. облегчение фагоцитоза чужеродных объектов макрофагами и нейтрофилами, обеспечение реализации реакции антитело зависимой клеточноопосредованной цитотоксичности, при помощи которой макрофаги, естественные киллеры и эозинофилы разрушают инфицированные, чужеродные и мутантные клетки человеческого организма. Кроме того, антитела способны активировать систему комплемента по классическому пути, что приводит к разрушению микроорганизмов и измененных человеческих клеток осмотическим лизисом.

Таким образом, в РВН на животных моделях исследуется только патоген нейтрализующее действие антител.

Достоинствами PВH с использованием животных являются ее универсальность и высокая специфичность; недостатки — большая трудоемкость; необходимость строго соблюдать стерильность материалов, посуды и инструментов; высокая стоимость живых биологических систем; относительная длительность биопробы и необходимость проведения математических расчетов [118].

1.4.4. Реакция вируснейтрализации на культуре клеток

Вариацией метода определения ВНА ЛП иммуноглобулинов методом РВН на животных моделях является оценка титра в РВН с использованием клеточных культур, основанный на способности ВНА ингибировать цитопатогенный эффект (ЦПЭ) вируса на чувствительной культуре клеток (Рис. 1.4) [60].

В опыте нейтрализации вирусную суспензию, содержащую определенную дозу вируса,

смешивают с разными дозами (разведениям) испытуемого препарата. После инкубации эту смесь соединяют с культурой клеток. Опыт ежедневно просматривают под микроскопом в течение 3-7

дней. Разведение испытуемого препарата, которое предотвращает развитие ЦПЭ, указывает уровень нейтрализующих антител относительно стандартного образца [119].

При постановке РВН на культуре клеток необходимо соблюдать несколько важнейших положений: в опыте необходимо использовать определенную дозу вируса, поэтому контрольное титрование вируса рекомендуется включать в каждую постановку опыта.

К преимуществам использования разработанного теста относится сокращение срока получения результатов с 14 до 3 сут, отсутствие необходимости использования животных, а