Добавил:

NancyDrew Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.

Вуз:

Пермская Государственная Фармацевтическая Академия

Предмет:

[НЕСОРТИРОВАННОЕ]

Файл:

12 Диссертация Смолянова

.pdf

Скачиваний:

Добавлен:

26.11.2023

Размер:

13.47 Mб

Скачать

☆

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 910 / 2210 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 > Следующая >>>

Таблица 4.21 - Оценка аттестованного значения специфической активности разработанного СОП-ФС-1 с использованием тест-системы ИФА ГНЦ

Стандарт

Оператор/

Среднее значение,

Среднее среднего

Стандартное

отклонение,

RSD, %

NIBSC

день

BAU/мл

значения, BAU/мл

BAU/мл

20/140

1/1

89,8

(Anti-RBD

1/2

80,0

85,8

4,4

5,2

IgG - 45

2/1

84,7

BAU/мл)

2/2

88,7

20/144

1/1

97,0

(Anti-RBD

1/2

85,2

93,4

5,8

6,3

IgG - 66

2/1

93,2

BAU/мл)

2/2

98,1

20/148

1/1

78,5

(Anti-RBD

1/2

80,9

78,0

2,8

3,6

IgG - 205

2/1

74,1

BAU/мл)

2/2

78,7

20/150

1/1

98,6

(Anti-RBD

1/2

102,2

98,0

3,1

3,2

IgG - 817

2/1

96,2

BAU/мл)

2/2

95,1

Итого

88,8

8,7

9,8

*RSD - Относительное стандартное отклонение

Таблица 4.22 - Оценка аттестованного значения специфической активности разработанного СОП-ФС-1 с использованием ИФА ЕИ

			Оператор/		Среднее значение,		Среднее среднего		Стандартное
	Стандарт NIBSC		Оператор/		Среднее значение,		Среднее среднего		отклонение,		RSD, %
	Стандарт NIBSC		день		BAU/мл		значения, BAU/мл		отклонение,		RSD, %
			день		BAU/мл		значения, BAU/мл		BAU/мл
									BAU/мл
20/140		1/1		113,4

		1/2		126,1
	(Anti-S1 IgG –	1/2		126,1		116,7		6,3		5,4

		2/1		114,2
	46 BAU/мл)	2/1		114,2

		2/2		113,0
		2/2		113,0

20/144		1/1		106,3

		1/2		104,1
	(Anti-S1 IgG –	1/2		104,1		101,0		11,0		10,9

		2/1		108,9
	50 BAU/мл)	2/1		108,9
	50 BAU/мл)	2/2		84,8
		2/2		84,8

20/148		1/1		97,6

		1/2		88,9
	(Anti-S1 IgG -	1/2		88,9		87,3		7,9		9,1

		2/1		83,5
	246 BAU/мл)	2/1		83,5

		2/2		79,2
		2/2		79,2

20/150		1/1		75,4

		1/2		82,8
	(Anti-S1 IgG -	1/2		82,8		76,8		6,9		9,0

		2/1		81,4
	766 BAU/мл)	2/1		81,4

		2/2		67,6
		2/2		67,6

			Итого			95,4		17,1		17,9

*RSD - Относительное стандартное отклонение

Таблица 4.23 - Оценка аттестованного значения содержания антител к SARS-CoV-2 в СОП-ФС- 1 и характеристики неопределенности аттестованного значения

Набор	Концентрация	Среднее	Стандартное	RSD, %	Значение
реагентов	специфических антител	значение,	отклонение,		доверительного
	в исследуемом образце,	BAU/мл	BAU/мл		интервала (при
	BAU/мл				Р=95%, ɑ=0,05)
ИФА	85,8
ГНЦ	93,4
	78,0
	98,0	96,8	13,3	13,7	6,8
ИФА ЕИ	116,7	96,8	13,3	13,7	6,8
ИФА ЕИ	116,7
	101,0
	87,3
	76,8

Коэффициент пересчета

Поэтому на следующем этапе работ была проведена оценка соотношения антиковидных единиц (АКЕ) и единиц связывания (BAU). Были использованы 40 серий плазмы человека,

содержащей антитела к SARS-СоV-2, протестированных относительно международной панели

NIBSC 20/268, охарактеризованной в единицах связывания BAU (binding antibody units), и

разработанного СОП-ФС-1, аттестованного в антиковидных единицах (АКЕ/мл), с

использованием метода ИФА (наборы реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ). Полученные результаты представлены в таблицах 4.24-4.26.

Таким образом, коэффициент пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в

международные единицы связывания (BAU/мл) составил 4,8 для набора реагентов ИФА ГНЦ, 5,0 для набора реагентов ИФА ЕИ.

Таблица 4.24 - Определение специфической активности плазмы человека, содержащей антитела к SARS-СоV-2, с использованием тест-систем ИФА ГНЦ

					Специфическая активность плазмы человека
					NIBSC 20/268, BAU/мл						СОП-ФС-1,
	№ п/п		20/140		20/144		20/148		20/150		АКЕ/мл

1		101,1		98,1		87,8		106,0		19,2
2		86,6		82,2		72,9		89,4		15,9
3		55,5		49,7		44,0		59,4		9,6
4		74,2		69,0		60,9		76,6		13,3
5		90,0		85,9		76,3		93,1		16,7
6		95,3		91,7		81,8		99,2		17,9
7		220,0		236,2		232,2		301,5		52,2
8		130,2		130,5		119,6		143,9		26,3
9		194,0		204,9		197,6		249,5		44,1
10		196,8		208,3		201,3		254,9		45,0
11		177,9		185,7		176,9		219,9		39,4
12		164,6		170,2		160,4		197,0		35,6
13		189,9		200,0		192,2		241,7		42,9
14		222,5		239,2		235,6		306,7		53,0
15		189,7		199,8		192,0		241,4		42,9
16		200,0		212,1		205,5		261,0		46,0
17		368,9		423,9		455,4		700,2		105,2
18		240,6		261,5		260,7		346,5		58,8
19		500,4		598,6		681,4		1196,7		160,2
20		497,8		595,1		676,7		1185,6		159,0
21		450,7		531,9		593,3		993,3		138,6
22		506,2		606,5		691,9		1221,9		162,8
23		391,9		454,0		493,2		777,3		114,3
24		314,2		353,6		369,0		533,8		84,4
25		133,6		134,3		123,4		148,7		27,2
26		172,1		178,9		169,6		209,7		37,7
27		107,3		104,8		94,3		113,4		20,7
28		80,9		76,2		67,4		83,4		14,7
29		79,9		75,0		66,3		82,3		14,5
30		112,6		110,8		100,0		120,2		21,9
31		138,4		139,9		129,0		155,8		28,5
32		127,3		127,3		116,3		139,8		25,6
33		108,1		105,8		95,2		114,5		20,9
34		85,3		80,9		71,7		88,0		15,6
35		112,0		110,0		99,3		119,3		21,8
36		105,5		102,9		92,4		111,3		20,2
37		151,6		151,3		138,2		166,1		30,4
38		107,3		102,4		90,9		111,1		19,9
39		162,1		149,9		138,9		181,4		30,8
40		103,6		103,4		96,0		121,3		21,2
	среднее
	арифметическое ±
	стандартное	59,6±		188,7±		203,6±		206,2±		46,9±
	отклонение	53,5		126,0		156,5		182,9		43,3

Таблица 4.25 - Определение специфической активности плазмы человека, содержащей антитела к SARS-СоV-2, с использованием тест-систем ИФА ЕИ

		Специфическая активность плазмы человека
		NIBSC 20/268, BAU/мл				СОП-ФС-1,
№ п/п	20/140	20/144	20/148	20/150		АКЕ/мл
1	127,1	120,7	100,9	81,2	18,7
2	107,1	99,8	84,0	68,7	15,3
3	77,7	70,0	61,0	52,4	10,8
4	82,7	75,0	64,8	55,1	11,5
5	90,4	82,8	70,7	59,2	12,7
6	123,8	117,2	98,1	79,0	18,2
7	286,6	296,6	261,9	215,3	52,0
8	136,9	130,3	136,5	161,0	24,6
9	171,4	167,9	141,2	112,1	26,9
10	303,7	316,3	281,5	233,4	56,1
11	317,8	332,5	297,9	248,7	59,5
12	170,6	167,1	140,5	111,6	26,8
13	203,2	202,7	172,4	137,4	33,3
14	272,7	280,8	246,3	201,2	48,7
15	243,7	247,9	214,6	173,2	42,1
16	256,0	261,9	227,9	184,9	44,9
17	410,2	441,0	411,6	360,4	83,6
18	371,0	394,7	362,2	310,7	73,1
19	778,4	895,9	949,3	989,5	200,2
20	702,3	799,6	828,7	836,3	173,8
21	522,2	576,0	562,0	521,3	115,9
22	677,8	768,7	790,8	789,4	165,5
23	432,8	468,0	440,9	390,7	89,9
24	445,7	483,4	457,9	408,5	93,5
25	186,3	184,2	155,6	123,7	29,9
26	235,8	239,1	206,1	165,9	40,3
27	135,6	129,6	108,3	86,7	20,2
28	111,9	104,8	88,0	71,6	16,1
29	109,7	102,5	86,2	70,3	15,8
30	138,5	132,7	110,9	88,6	20,8
31	167,1	163,3	137,1	108,9	26,1
32	182,0	179,5	151,4	120,3	29,0
33	134,1	128,1	107,0	85,7	20,0
34	124,6	118,0	98,7	79,5	18,3
35	145,8	140,5	117,4	93,6	22,1
36	121,2	114,5	95,9	77,4	17,7
37	173,2	166,7	139,4	111,1	26,2
38	150,4	142,5	119,2	96,0	22,1
39	198,1	179,8	150,3	120,2	28,2
40	177,2	155,7	131,2	102,2	24,0
среднее
арифметическое
± стандартное	68,1±	245,1±	254,5±	235,1±	46,8±
отклонение	68,6	174,2	204,4	215,4	45,8

Таблица 4.26 - Определение коэффициента пересчета антиковидных единиц (АКЕ/мл) в международные единицы связывания (BAU/мл)

Наборы	Специфическая активность препаратов иммуноглобулинов							Коэфф.
реагентов	(среднее арифметическое ± стандартное отклонение)							пересчета
		NIBSC 20/268, BAU/мл					СОП-
	20/140	20/144	20/148	20/150	Средние		ФС-1,
					значения		АКЕ/мл
ИФА ГНЦ	59,6±	188,7±	203,6±	206,2±	224,4±	46,9±		4,8
	53,5	126,0	156,5	182,9	197,7	43,3

ИФА ЕИ	68,1±	245,1±	254,5±	235,1±	236,1±	46,8±		5,0
	68,6	174,2	204,4	215,4	203,1	45,8

4.4. Изучение стабильности СОП-ФС-1 и установление срока годности

Стабильность стандартных образцов является одной из их важнейших характеристик. С

целью изучения стабильности и установления срока годности СОП-ФС-1 для определения специфической активности было сформировано 40 комплектов одной серии СОП-ФС-1,

представленные 10 ампулами флаконами (по 1,0,15 мл).

Для подтверждения достоверности полученных значений специфической активности была проведена проверка валидационных параметров методики, с помощью которой определяли специфическую активность. Полученные значения валидационных параметров соответствовали критериям приемлемости: прецизионность и правильность должны быть не более ±25 % для образцов на уровне верхнего и нижнего предела количественного определения и не более ±20 %

для остальных образцов, а общая ошибка метода должна быть не более 40 % для образцов на уровне верхнего и нижнего предела количественного определения и не более 30 % для остальных образцов (Табл. 4.27).

При исследовании стабильности определяли зависимость изменения показателя специфической активности СОП-ФС-1 от времени хранения при температуре хранения -20 °С.

Для этого в СОП-ФС-1 определяли контролируемый параметр (специфическая активность) в

момент закладки на хранение, далее ежемесячно в течение первых 3 месяцев, далее с интервалом в 3 месяца до 21 месяца.

Также дополнительно исследовали стабильность СОП-ФС-1 при повышенной температуре 18-25 оС, т.к. это комнатная температура, при которой проходит постановка реакции.

Время анализа занимает от 4 до 6 часов. При этом повышенную температуру выбрали экспериментально, чтобы определить длительность периода, при котором не происходит статистически значимого падения активности после восстановления образца при 18-25 оС.

Представленные в таблице 4.27 данные по оценке стабильности позволяют сделать вывод

отом, что СОП-ФС-1 после восстановления образца стабилен в течение 16 часов хранения при температуре 18-25 оС, значит он стабилен в течение всего времени постановки реакции.

Представленные в таблице 4.28 данные по оценке стабильности позволяют сделать вывод

отом, что СОП-ФС-1 для определения специфической активности стабилен в течение 21 месяца хранения при температуре -20 оС. Для установления окончательного срока годности наблюдения продолжаются.

Таблица 4.27 - Прецизионность, правильность и общая ошибка при изучении специфической активности СОП-ФС-1 с использованием тест-системы ИФА ГНЦ при оценке стабильности в течение 6 часов хранения при температуре 18-25 оС

Аналитические		Образцы для контроля качества
характеристики	0,200	0,100	0,050	0,025	0,012	0,006
	АКЕ/	АКЕ/	АКЕ/	АКЕ/	АКЕ/	АКЕ/
	мл	мл	мл	мл	мл	мл

Специфическая активность при оценке стабильности образцов КК в течение 16 часов хранения при температуре 18-25 оС

Среднее значение,	0,198	0,101	0,051	0,025	0,012	0,007
АКЕ/мл	0,198	0,101	0,051	0,025	0,012	0,007
АКЕ/мл

Стандартное	0,0147	0,0123	0,0065	0,0011	0,0004	0,0005
отклонение, АКЕ/мл	0,0147	0,0123	0,0065	0,0011	0,0004	0,0005
отклонение, АКЕ/мл

Прецизионность, %	7,4	12,2	12,7	4,4	3,3	7,1

Правильность, %	-1,0	1,0	2,0	0	0	16,7

Общая ошибка, %	8,4	13,2	14,7	4,4	3,3	23,8

Специфическая активность при оценке стабильности образцов КК в течение 2 месяцев хранения при температуре - 35 оС и ниже

Среднее значение,	0,180	0,092	0,045	0,021	0,011	0,006
АКЕ/мл


Стандартное	0,0002	0,0029	0,0014	0,0009	0,0007	0,0001
отклонение, АКЕ/мл


Прецизионность, %	0,1	3,2	3,1	4,3	6,4	1,7


Правильность, %	-10,0	-8,0	-10,0	-16,0	-8,3	0


Общая ошибка, %	10,1	11,2	13,1	20,3	14,7	1,7

Таблица 4.28 - Изучение специфической активности СОП-ФС-1 с использованием тест-системы ИФА ГНЦ при оценке стабильности при температуре - 20 оС

Срок наблюдения					Среднее значение, АКЕ/мл
			0,200	0,100		0,050	0,025	0,012	0,006
			АКЕ/мл	АКЕ/мл		АКЕ/мл	АКЕ/мл	АКЕ/мл	АКЕ/мл
0	месяцев		0,198	0,101		0,051	0,025	0,012	0,007

1	месяц		0,196	0,102		0,053	0,024	0,011	0,006

2	месяца		0,197	0,103		0,052	0,023	0,012	0,007

3	месяца		0,198	0,102		0,053	0,024	0,012	0,007

6	месяцев		0,196	0,102		0,051	0,024	0,011	0,006

9	месяцев		0,197	0,102		0,053	0,023	0,012	0,006

12		месяцев	0,198	0,101		0,052	0,024	0,011	0,007

15		месяцев	0,197	0,103		0,053	0,025	0,012	0,007

18		месяцев	0,197	0,101		0,051	0,025	0,011	0,006

21		месяц	0,196	0,101		0,051	0,023	0,012	0,007

		4.5. Получение	вторичного стандартного				образца	для количественного

определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции

Для рутинного использования в оценке уровня специфической активности в образцах котловых загрузок плазмы крови человека в производстве ЛП ИГЧ против COVID-19,

предполагающей большое количество исследований, была разработана лиофильная форма вторичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в

фармацевтической субстанции (СОП-ФС-2) по той же схеме, что и первичного стандартного образца СОП-ФС-1. Для обеспечения стабильности физико-химических и биологических свойств СОП-ФС-2 были использованы сахароза в конечной концентрации 2 %, стерильный розлив по 0,1 мл во флаконы, лиофильное высушивание, герметизация флаконов аналогично получению СОП-ФС-1 (п. 4.1.1.). Была проведена оценка качества разработанного СОП-ФС-2 в

соответствии с показателями качества СОП-ФС-1 и требованиями к соответствующим показателям качества плазмы для фракционирования, аналогично п 4.1.2.

Было установлено, что значение показателей качества разработанного СОП-ФС-2

соответствует показателям качества СОП-ФС-1 и требованиям к соответствующим показателям качества плазмы для фракционирования.

СОП-ФС-2 был использован в ИФА тест-системах для количественного определения уровня антител к SARS-СоV-2 в образцах котловых загрузок плазмы крови человека при получении ЛП иммуноглобулина против COVID-19.

4.6. Аттестация вторичного стандартного образца для количественного определения антител к SARS-CoV-2 в фармацевтической субстанции по показателю специфической активности в антиковидных единицах

На следующем этапе работ было проведено установление значения специфической активности вторичного стандартного образца (СОП-ФС-2) в антиковидных единицах (АКЕ/мл)

в миллилитре (АКЕ/мл) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в модификации для количественного определения с использованием СОП-ФС-1 в качестве калибратора.

Работы проводились тремя операторами в течение двух дней в двух повторностях. Для полученных значений уровней специфических антител (АКЕ/мл) были рассчитаны величины:

среднее значение, стандартное и относительное стандартное отклонения (RSD, %). Результаты полученных значений специфической активности СОП-ФС-2 с использованием наборов реагентов ИФА ЕИ и ИФА ГНЦ приведены в таблицах 4.29 и 4.30 соответственно.

Таблица 4.29 - Определение специфической активности СОП-ФС-2 с использованием набора реагентов ИФА ЕИ

	Оператор		Найдено (АКЕ/мл)			Найдено (АКЕ/мл),	RSD, %
	Оператор		Найдено (АКЕ/мл)			среднее значение
						среднее значение
1, 2, 3		32,3		32,3	36,4		6,9

		39,7		35,3

		37,7		36,4

		36,6		37,0

		33,6		33,6

		36,5		35,4

		36,1		37,4

		43,0		38,2

		35,3		36,4

		34,2		38,4

		34,3		38,5

		39,9		35,6

Для значений концентраций специфических антител в СОП-ФС-2, полученных с использованием ИФА ЕИ и ИФА ГНЦ рассчитывали по формулам согласно ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» показатели: среднее значение, стандартное и относительное стандартное отклонения, а также значение доверительного интервала (Табл. 4.31).

Таблица 4.30 - Определение специфической активности СОП-ФС-2 с использованием набора реагентов ИФА ГНЦ

	Оператор		Найдено (АКЕ/мл)			Найдено (АКЕ/мл),		RSD, %
	Оператор		Найдено (АКЕ/мл)			среднее значение		RSD, %
						среднее значение
1, 2, 3		40,3		43,8	41,4		15,7

		36,3		38,9

		38,0		38,7

		38,4		42,1

		43,9		45,0

		47,8		44,7

		52,4		45,1

		57,4		51,2

		42,4		38,5

		33,2		32,5

		36,8		30,8

		41,5		34,0

Таблица 4.31 - Оценка аттестованного значения специфической активности СОП-ФС-2 и характеристики неопределенности аттестованного значения

Набор	Концентрация	Среднее	Стандартное	RSD,	Значение	Содержание
реагентов	специфических	значение,	отклонение,	%	доверительног	специфически
	антител в	АКЕ/мл	АКЕ/мл		о интервала	х антител,
	исследуемом				(при Р=95%,	АКЕ/флакон
	образце, АКЕ/мл				ɑ=0,05)
ИФА ЕИ	36,4	38,9	5,5	14,1	±1,6	4

ИФА ГНЦ	41,4

По результатам статической обработки результатов аттестации специфическая активность СОП-ФС-2 была принята за 40 АКЕ/мл.

Для постановок определения значения специфической активности СОП-ФС-2 методом ИФА с использованием наборов реагентов ИФА ГНЦ и ИФА ЕИ в модификации для количественного определения с использованием СОП-ФС-1 в качестве калибратора были изучены линейность и параллелизм в соответствии с инструкцией по применению компьютерной программы «Паралайн», разработанной в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича (Табл. 4.32 и 4.33, Рис. 4.8;

4.9).

100

Таблица 4.32 - Оценка параметров линейность и параллелизм определения значения специфической активности СОП-ФС-2 методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы ИФА ГНЦ

	Источник вариации		Степень		Сумма		Средний		F-		F-экспер.		Вывод
			свободы		квадратов		квадрат		теор.

Измерения (дозы)		9		2,9539		0,3282		3,02		974,74		Значимо

Препараты		1		0,3916		0,3916		4,96		1162,85		Значимо

Линейная регрессия		1		2,5572		2,5572		4,96		7594,38		Значимо

Параллелизм		1		0,0005		0,0005		4,96		1,49		ДА

Линейность		6		0,0047		0,0008		3,22		2,33		ДА

Остаточная ошибка		10		0,0034		0,0003

Total		19		2,9573

Таблица 4.33 - Оценка параметров линейность и параллелизм определения значения специфической активности СОП-ФС-2 методом ИФА с использованием тест-системы ИФА ЕИ

Источник вариации	Степень	Сумма	Средний	F-	F-экспер.	Вывод
	свободы	квадратов	квадрат	теор.
Измерения (дозы)	9	3,2623	0,3625	3,02	207,50	Значимо

Препараты	1	0,4328	0,4328	4,96	247,77	Значимо

Линейная регрессия	1	2,8160	2,8160	4,96	1611,99	Значимо

Параллелизм	1	0,0074	0,0074	4,96	4,23	ДА

Линейность	6	0,0061	0,0010	3,22	0,58	ДА

Остаточная ошибка	10	0,0175	0,0017

Total	19	3,2798

		Сравнение испытуемых образцов со стандартным препаратом						0,6
		Сравнение испытуемых образцов со стандартным препаратом
								0,4
, lg								0,2
плотность								0
	-1,4	-1,2	-1	-0,8	-0,6	-0,4	-0,2	-0,2	0
								-0,4
Оптическая								-0,4
								-0,6
								-0,8
								-1

								-1,2
				Кратность разведения, log2
						СОП-ФС-1		СОП-ФС-2
						Ряд2
Рисунок 4.8 - Результаты изучения линейности и параллелизма СОП-ФС-1 и СОП-ФС-2 с
			использованием тест-системы ИФА ГНЦ

<<< < Предыдущая 1 2 3 4 5 6 7 8 910 / 2210 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 > Следующая >>>

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

#
26.11.202313.47 Mб212 Диссертация Смолянова.pdf
#
26.11.2023663.17 Кб015 Автореферат Смолянова-2.pdf
#
26.11.2023768.72 Кб2АВТОРЕФЕРАТ Сушкова М.С.-1.pdf
#
26.11.20239.37 Mб1Диссертация Сушковой М.С.pdf