книги / Наноструктурированная керамика на основе диоксида титана для ортопедического этапа лечения пациентов с переломами и приобретенными дефектами челюстных костей

патофизиологического опыта структурно-функциональные изменения помогают устанавливать и объективно трактовать механизмы патологических процессов, происходящихвпрототипе– человеке.

На этапе, предшествующем материальному моделированию, для определения показателей видовой реактивности был произведен тщательный отбор половозрелых нелинейных белых крыс в возрасте 2,0–2,5 мес. Учитывая возможность сезонного влияния на биометрические параметры организма, все животные целенаправленно взяты из второго сентябрьского помета с характерным для него многочисленным сильным приплодом. Анатомо-физиологические особенности, зоосоциальное поведение отобранных 9 самцов были сопоставимы и соответствовали III репродуктивному периоду [47].

Беспородные белые крысы (Rat outbred albus) отличались нормальным физическим развитием. Имели густой гладкий глянцевый шерстный покров и четко дифференцированные вторичные половые признаки, определяющие их полопринадлежность. Зубы грызунов не имели признаков повышенного стирания и изменений в цвете.

Известно, что антропометрические данные лабораторных животных во многом зависят от особенностей их содержания и кормления. Для сравнения показателей массы тела отобранных нелинейных Rats outbreds albus в возрасте 8–10 недель мы использовали нормативную динамику веса у беспородных половозрелых крыссамцов в необходимом временном срезе их онтогенеза в соответствии с параметрами, установленными на территории Российской Федерации (табл. 4.1).

Приведенные в табл. 4.1 индивидуальные показатели массы тела взятых нами 9 экспериментальных животных коррелировали с нормальными референс-значениями этого признака у беспородных крыс в соответствии с выбранным отрезком времени. Важно отметить, что разброс по исходным результатам у самцов, введенных

вматериальное моделирование, не должен превышать 10 % [47]. Разрыв между минимальным (295,0 г) и максимальным (324,0 г) весом

впроводимом опыте составил 9,1 %.

111

Таблица 4 . 1

Нормы массы тела беспородных крыс-самцов, установленные на территории Российской Федерации, в сопоставлении

с индивидуальными параметрами массы экспериментальных нелинейных животных в возрасте 8–10 недель

Примечание: * – нормативныепараметрывзятыиз[47].

В экспериментальных и биомедицинских исследованиях крысы служат одним из наиболее востребованных объектов доклинических испытаний. Токсикологический анализ можно проводить как на линейных, так и на нелинейных Rats outbreds albus [47]. Вместе с тем, в соответствии с международными правилами, для достижения воспроизводимости результатов при физическом моделировании желательным является применение здоровых животных с определенным генетическим и микробиологическим статусом [57]. Это, безусловно, снижает вариабельность изучаемых показателей реактивности и резистентности организма, но увеличивает достоверность установленных фактов. При прочих равных условиях в исследованиях по определению острой и хронической токсичности предпочтительнее использование аутбредных животных. Именно аутбредные линии крыс – Sprague Dawley (SD) – в мировой, в том числе и российской, практике наиболее часто используются для выявления безопасности потенциальных

112

биологически активных веществ, лекарственных препаратов, а также в испытании общей токсичности различных биохимических и химических соединений. Линия Sprague Dawley – категория грызунов, свободных от патогенной флоры (СПФ). Другими словами, биоценотический уровень крыс категории СПФ являет собой пример «эталонной» экологической пирамиды, в которой чем выше этот уровень, тем ниже общая биомасса и количество микроорганизмов, заселяющих определенные биотопы, следовательно, тем совершеннее организация самой живой материи

ивещественно-энергетические круговороты в ней.

Вситуации, когда в качестве биомодели выбираются нелинейные животные, только оптимизация симбиотических влияний внешних и внутренних факторов дает возможность, не изменяя генотипа, повысить «статусность» его фенотипа. При этом условия могут усилить, ослабить или даже отменить повреждение, так как они неравноценны по своему воздействию на биологические объекты. Однако только их биологически целесообразный суммарный эффект вносит существенный вклад в обеспечение структурно-функциональной целостности организма и его реактивности в целом – реактивности как совокупности видовых, половых, возрастных, конституциональных и индивидуальных особенностей, определяющих характер реагирования объекта на

действие физиологических и патологических раздражителей. В этом случае как нельзя лучше подходит изречение великого естествоиспытателя Леонардо да Винчи: «Опыт не ошибается, ошибаются только суждения наши, которые ждут от него вещей, не находящихся в его власти».

Исходя из сказанного, мы сопоставили антропометрические данные массы тела беспородных половозрелых крыс с аналогичными параметрами линейных животных СПФ, так как 9 самцов, отобранных для изучения фоновых показателей групповой реактивности, относились к категории грызунов с неустановленным микробиологическим статусом (табл. 4.2).

113

Таблица 4 . 2

Динамика изменения массы линейных и беспородных крыс-самцов в возрасте 8–10 недель жизни

Примечание: * – цитировано по [8].

Анализируя индивидуальные замеры массы опытных крыс с неконтролируемым генетическим статусом в возрасте 8–10 недель, нетрудно заметить, что они не только не противоречили нормативным значениям оцениваемого признака категорийных самцов, но и в 8 из 9 экспериментальных случаев превосходили значение указываемой массы тела – 313,6 г у животных линии Sprague Dawley в возрасте 2,0–2,5 мес. Однако при сопоставлении средних значений массы животных статистически значимых различий установлено не было (см. табл. 4.2). Приступая к материальному моделированию, мы не искали альтернативной замены грызунам аутбредной линии SD, а лишь допустили равенство возможностей использования беспородных половозрелых крыс-самцов в планируемых доклинических исследованиях.

Таким образом, результаты, полученные при сравнении массы экспериментальных нелинейных животных с нормативными значениями беспородных крыс-самцов, установленными на территории Российской Федерации, и показателями веса крыс СПФ, свидетель-

114

ствовали о доминировании анаболических процессов над процессами катаболического распада в организме, а, следовательно, косвенно об отсутствии у испытуемых грызунов Rats outbreds albus скрытых очагов инфекционных и паразитарных заболеваний.

Для нормальной жизнедеятельности, действительно, важны оптимальные условия окружающей среды. Вместе с тем для поддержания индивидуального гомеостаза, обеспечения «свободной жизни» необходимы сохраненная морфологическая организация и соподчиненная ей комплементарная деятельность органов, а также дискретность функционирования клеток, объединенных в различные ткани. Все это в своей совокупности обеспечивает струк- турно-функциональное единство биосистемы, возможность регулярного самообновления отдельных ее элементов.

Кровь – одна из интегрирующих систем организма, тонко отражающая реакцию кроветворных органов на эндогенные и экзогенные воздействия. Эффективная работа этой биологической ткани зависит от количественных и качественных характеристик ее клеточного состава. Нарушения многочисленных функций крови связаны с изолированным или комбинаторным изменением активности ее компонентов.

Для подтверждения корректного отбора крыс-самцов с целью формирования контрольной группы для последующих доклинических исследований возникла насущная необходимость проанализировать показатели периферической крови у конвенциональных грызунов и сопоставить их прежде всего с линейными Sprague Dawley, свободными от патогенной флоры. На ночь перед забором крови животных лишали корма без ограничения доступа к воде.

Взятие крови у крыс проводили до операции имплантации (исходный уровень) и по окончании исследования (на 28-е сутки); при этом кровь забирали из хвостовой вены на раствор гепарина (50 ЕД/мл). Определяли количество эритроцитов (106 клеток в 1 л), лейкоцитов (103 клеток в 1 л), концентрацию гемоглобина (г/дл), гематокрит (%), количество тромбоцитов (109 клеток в 1 л), тромбокрит

(%). Регистрировали показатели крови на гематологическом автома-

тическом анализаторе Medonic M20 (Boule Medical A.B., Швеция).

115

Таблица 4 . 3

Показатели периферической крови половозрелых крыс-самцов линии Sprague Dawley и экспериментальных беспородных крыс в возрасте 2,0–2,5 мес.

Примечание: * – референс-значения гематологических показателей крыс линии Sprague Dawley взяты из работы [8]. Жирным шрифтом выделена статистическая значимость различий.

116

Из нативной капли крови готовили мазок, фиксировали в растворе Майн – Грюнвальда и подвергали окрашиванию по Романовскому – Гимзе. Окрашенные мазки микроскопировали под иммерсией (Micros, Austria, × 1000), проводили анализ лейкоцитарной формулы, определяя относительное содержание клеток в мазке

иабсолютные их значения.

Спозиций жесткого прагматизма трудно не признать наличие парциальных сдвигов и достоверную разницу между содержанием форменных элементов в лейкоцитарной формуле Rats outbreds albus

иреференс-значением гематологических показателей крыс категории СПФ (табл. 4.3).

Наибольшие количественные изменения регистрировали среди эозинофилов, нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов. Значимые различия выявлены не только в среднеарифметических данных, но и в диапазоне колебания минимальных – максимальных величин указанных видов клеток крови (см. табл. 4.3). При сопоставимом

формулы в первом случае определяли лимфоциты, во втором – полинуклеарные формы (эозинофилы и нейтрофилы). Полученные результаты косвенно свидетельствовали о несоответствии «экологического» статуса экспериментальных Rats outbreds albus стандарту, характерному для грызунов Sprague Dawley.

Вместе с тем количество эритроцитов, лейкоцитов в циркуляции находится в прямой зависимости от действующих факторов, прежде всего внешних влияний, способа взятия крови, пищевого режима, возраста животного и др.

В ходе проводимого нами материального моделирования была обеспечена максимально возможная стандартизация условий содержания лабораторных крыс при автоматической смене 12-часо- вого светового периода. Учитывались также все особенности половой, возрастной, конституциональной реактивности, чтобы минимизировать возможность биоритмических изменений картины крови у лабораторных животных. Однако различным оказался метод забора биоматериала у линейных и нелинейных самцов, а в кро-

117

ви, полученной из различных регионов сосудистого русла, как известно, находится далеко не одинаковое количество форменных элементов, особенно лейкоцитов. В нашем эксперименте взятие крови проводили из хвостовой вены, тогда как у аутбредной линии грызунов Sprague Dawley – из нижней полой вены, предварительно подвергая животных анестезии с помощью СО2 в камере.

Оставляя за собой право выбора метода венепункции, мы исходили не столько из технической простоты забора крови, сколько из возможности столкнуться с риском диссоциации вентиляционноперфузионного соотношения в условиях повышения парциального напряжения углекислоты во вдыхаемом воздухе (↑раСО2), а следовательно, опасностью развития дыхательной гипоксии. Вне зависимости отпроисхождения, главнымзвеномеепатогенезаслужитартериальная гипоксемия, какправило, сочетающаясясгиперкапниейиацидозом.

При оценке эритроцитарных показателей крови, индексов и средних значений у обеих категорий животных была установлена их тождественность, за исключением данных гематокрита (Ht). Ht является расчетным параметром, зависящим от количества эритроцитов (RBC) и суммы клеточных объемов (МСV). Учитывая, что сравниваемые средние величины RBC (7,85 ± 0,10 – у линейных крыс SD и 7,31 ± 0,25 – у беспородных самцов), МСV (59,20 ± 0,70 против 59,50 ± 2,21 соответственно) оказались сопоставимыми, то выявленные статистически значимые различия Ht у животных (46,10 ± 0,50 и 43,23 ± 0,96 – в эксперименте) можно отнести к гематологическим особенностям лабораторных Rats outbreds albus (см. табл. 4.3). Принято считать, что чем выше объемная фракция эритроцитов в цельной крови – гематокрит, тем реальнее угроза возникновения гемоконцентрационных сдвигов. Показатель Ht

вэтих случаях является ориентиром в суждениях о характере изменения общего объема крови, диспропорциях в соотношении форменных элементов и ее жидкой части – плазмы.

На завершающем этапе исследования для презентирования полученных результатов групповой реактивности отобранных самцов

ввозрасте 2,0–2,5 мес. в качестве основных, т.е. кардинальных,

118

признаков у конвенциональных животных мы сравнили гематологические показатели беспородных Rats outbreds albus, принятые на территории Российской Федерации, с данными исходного фона в эксперименте (табл. 4.4).

Таблица 4 . 4

Гематологические показатели беспородных белых крыс-самцов, принятые на территории Российской Федерации, в сопоставлении с данными исходного фона в эксперименте

Выявленные статистически значимые различия в лейкоцитарной формуле определили фактическое доминирование лимфоцитов, эозинофилов и моноцитов у 9 исследуемых грызунов относительно установленных норм для беспородных половозрелых крыс, используемых в доклинических испытаниях на территории РФ. Придавая большую значимость оценке абсолютного содержания указанных

119

видов клеток, мы понимали, что именно их величины отражают истинное количество лейкоцитов в единице объема крови, а значит потенциал кооперативных специфических функций, включая селективные эффекты агранулоцитов и эозинофильных полинуклеаров. Работая синхронно, лимфоциты, моноциты, эозинофилы мобилизуют ресурсы иммуногенной реактивности, вносят существенный положительный вклад в биоценотический уровень животных с неопределенным генетическим и микробиологическим статусом.

Таким образом, установленный в первой фазе патофизиологического эксперимента диапазон отклонений отдельных параметров реактивности грызунов разных категорий свидетельствовал о «пластичности» показателей жизнедеятельности изучаемых крыс-самцов, которые, на наш взгляд, носили приспособительный характер, что обеспечивало мобилизацию защитных факторов для достижения равновесия организма с внешней и внутренней средой в конкретный промежуток времени и в конкретной обстановке. При этом биологическая – первичная – реактивность отобранных конвенциональных животных представлялась нам оптимальной для дальнейшего изучения механизмов действующих на организм повреждающих факторов и условий, способствующих возникновению различных сдвигов в гомеостазе изучаемых Rats outbreds albus.

Изучение показателей первичной реактивности конвенциональных крыс-самцов при имплантации им медицинского стекла и образцов диоксида титана с различными вариантами

технологической обработки

Признавая важность использования животных для фундаментальных и прикладных исследований, соблюдение биоэтических норм эксперимента явилось для нас обязательным условием его проведения. Понимание необходимости рационализации опыта и ограничения количества объектов для реализации поставленных задач определило минимально необходимое количество Rats outbreds albus, достаточного для воспроизводства и получения статистически достоверных результатов в нашей работе.

120