6.Во второй половине XX столетия биология вступила в свой «Золотой век». Достижения молекулярной биологии, биохимии и генетики дали начало новому разделу науки – генной инженерии и биотехнологии.

Цель генной инженерии - конструирование генетических структур по зарание намеченному плану, создание организмов с новой генетической программой, путем переноса генетической информации из одного организма в другой.

Генетическая инженерия создает задели на пути познания способов и путей «конструирования» новых или улучшения существующих организмов, придавая им большую хозяйственную ценность и способность резкого увеличения продуктивности биотехнологических процессов. Генетическая инженерия и биотехнология стимулировали разработку методов бионанотехнологиии.

В рамках генетической инженерии различают генную и клеточную инженерию. Под генной инженерией понимают манипуляции с целью создания рекомбинантных молекул ДНК. Часто эту методологию называют молекулярным клонированием, клонированием генов, технологией рекомбинантных ДНК или просто генетическими манипуляциями. Важно подчеркнуть, что объектом генной инженерии являются молекулы ДНК, отдельные гены. Напротив, под клеточной инженерией понимают генетические манипуляции с изолированными отдельными клетками или группами клеток растений и животных.

Главные вехи в развитии генной инженерии представлены в табл. 1.

1970 г. – Келли и Смит выделили рестриктазу.

1972 г. – П. Берг получил invitro рекомбинантную ДНК.

1978 г. – создан генно-инженерный инсулин и гормон роста человека.

1986 г. – создан вакцина против гепатита В и интерферон.

1987 г. – первые полевые испытания генетически модифицированных с/х растений (томат, устойчивый к вирусным заболеваниями).

1990 г. – начало международного проекта «Геном человека».

1990 г. – впервые успешно проведена генная терапия четырехлетней девочки с нарушением иммунитета.

1993 г. – начато продажа продуктов питания, содержащих генетически модифицированные организмы.

1997 г. – Я. Уилмут и К. Кэмпбелл – «овечка Долли».

1997 г. – клонированы овцы, которые несли человеческий ген «антигемофильного фактора IX».

1998 г. – выращиваются эмбриональные стволовые клетки.

1998 г. – впервые создана полная генетическая карта животного (Caenorhabditiselegans).

2001 г. – создана первая полная генетическая карта риса.

2003 г. – завершение проекта «Геном человека».

2003 г. – проект «Encode».

2007 г. – завершение первого этапа проекта «Encode».

Первым этапом методов генной инженерии является получение наследственного материала. Небольшие гены прокариот можно синтезировать химическим путем, если полностью известна последовательность нуклеотидов. Так впервые в 1970 году Г. Корана синтезировал ген аланиновой т-РНК. Синтез сложных генов проводят с помощью обратной транскрипции методом ферментативного синтеза. В качестве матрицы используют выделенную и-РНК. С помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) на ней синтезируют кодирующую нить ДНК, которую затем реплицируют (для получения второй, комплементарной нити ДНК). Полученные таким способом гены не функционируют в клетках, так как не имеют промотора и регуляторной части. При переносе в бактерию к структурным генам присоединяют промотор оперона, и транскриптон начинают работать.

Необходимые для пересадки гены можно получать с помощью рестриктаз. Рестриктазы – ферменты, открытые в 1964 году. К настоящему времени их выделено более 500. Они могут узнавать определенные последовательности нуклеотидов вырезать эти участки из цепи ДНК. На концах фрагмента ДНК образуются одноцепочечные «липкие концы».

Полученные гены соединяют с векторными молекулами, которыми могут быть плазмиды бактерий, вирусы и фаги. Рестриктаза разрывает кольцевую ДНК плазмиды, в нее вводят ген (участок ДНК). Фермент лигаза соединяет липкие концы плазмиды с липкими концами гена и получается молекула рекомбинантной ДНК. Такая ДНК способна проникать в клетку – реципиент.

Рекомбинантные молекулы ДНК попадают не во все клетки. Поэтому на специальных питательных средах проводят отбор трансформированных клеток с введенным в них геном. Далее проводят размножение клеток с рекомбинантной ДНК и получают клон клеток с определенными свойствами.

В основе генной инженерии лежит целенаправленное манипулирование с фрагментами нуклеиновых кислот. Генная инженерия успешно развивается с 1970 года.

Этапы методов генной инженерии:

1. Получение генетического материала.

2. Анализ фрагментовДНК.

3. Конструирование векторной молекулы ДНК invitro, способной реплицироваться автономно invivo.

4. Введение рекомбинантных ДНК в клетку – реципиент.

5. Селекция клонов клеток, содержащих молекулы гибридной ДНК.

Способы получения генов:

1. Матричный синтез (биоферментативный) – обратная транскрипция генов с помощью ревертазы:

• и-РНК используется как матрица для синтеза цепи ДНК.

• цепь ДНК реплицируют при помощи ДНК-полимеразы.

2. Химико – ферментативный синтез invitro:

• можно синтезировать короткие гены с известной последовательностью (секвенированние).

• для секвенирования генов используют методы:

→Максама–Гилберта (1977).

→Сэнгера (1975).

Метод Максама – Гилберта основан на химической деградации ДНК.

□Один из концов секвенируемого фрагмента ДНК помечают³²Р или флюорисцирующей меткой.

□Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентами, специфически разрушающими одно из четырех оснований ДНК: А, Г, Т, Ц.

Метод Сэнгера основан на включении модифицированных нуклеотидов в синтезирующуюся цепь ДНК, являющихся терминаторами элонгации.