токсикология

метаболитов: октаметил превращается в более токсичный фосфорамидоксид; тиофос окисляется до более активного параоксона.

В ряде случаев в ходе биотрансформации ксенобиотиков образуются вещества, способные совершенно иначе действовать на организм, чем исходные агенты. Так, некоторые спирты (этиленгликоль), действуя целой молекулой, вызывают седативно-гипнотический эффект (опьянение, наркоз). В ходе их биотрансформации образуются соответствующие альдегиды и органические кислоты (щавелевая кислота), способные повреждать паренхиматозные органы и, в частности, почки. Многие низкомолекулярные вещества, являющиеся факультативными аллергенами, подвергаются в организме метаболическим превращениям с образованием реакционноспособных промежуточных продуктов. Так, соединения, содержащие в молекуле аминоили нитрогруппу в ходе метаболизма превращаются в гидроксиламины, активно взаимодействующие с белками крови и тканей, формируя полные антигены. При повторном поступлении таких веществ в организм помимо специфического действия развиваются аллергические реакции.

Порой сам процесс метаболизма ксенобиотика может являеться пусковым звеном в развитии интоксикации. Например, продуктами биологического окисления ароматических полициклических углеводородов (ПАУ) являются ареноксиды (рис.15), которые образуют ковалентные связи с нуклеофильными структурами клеток (белками, сульфгидрильными группами, нуклеиновыми кислотами и т.д), активируют пероксидное окисление липидов биологических мембран. В итоге проявляется мутагенное, канцерогенное, цитотоксическое действие токсикантов.

ПАУ ареноксид Рис.15. Образование ареноксидов в процессе метаболизма ПАУ

141

Аналогично ареноксидам действуют N-оксиды, нитрозамины, гидроксиламины, галогенированный бензол и другие токсиканты, являющиеся канцерогенами и мутагенами.

Изучение биотрансформации токсических веществ представляет не только общебиологический интерес, но является важным и в практическом отношении. Представление о механизмах биотрансформации, о последовательности и скоростях превращения того или иною вещества в организме могут быть использованы для активного вмешательства в эти процессы (например, с целью замедления или ускорения образования какого-либо метаболита, ускорения его связывания и т. п.), т. е. могут быть использованы для профилактики и патогенетической терапии, а также в целях диагностики интоксикации.

Основным органом метаболизма ксенобиотиков в организме млекопитающих является печень, главным образом благодаря разнообразию и высокой активности здесь ферментов биотрансформации. Кроме того, портальная система обеспечивает прохождение всех веществ, поступивших в желудочнокишечный тракт, именно через печень, до того, как они проникнут в общий кровоток. Богатая сеть печеночных капилляров, огромная площадь контакта между кровью и поверхностью гепатоцитов, обеспечивающаяся микроворсинками базальной поверхности печеночных клеток, обусловливают высокую эффективность печеночной элиминации токсиканта на клеточном уровне.

Продукты 1-ой фазы метаболизма поступают в общий кровоток и могут оказывать токсическое действие на органы и системы. Из печени высвобождаются в кровь и продукты 2-ой фазы метаболизма. Из крови продукты превращения могут захватываться почками, легкими, другими органами, повторно печенью для экскреции с желчью. С желчью метаболиты поступают в кишечник, где частично реабсорбируются и повторно поступать в печень (цикл печеночной рециркуляции).

142

Несмотря на доминирующую роль печени в метаболизме чужеродных веществ, другие органы также принимают участие в этом процессе. Почки и легкие также содержат ферменты и 1-ой и 2-ой фаз метаболизма. Особенно велика роль почек, поскольку в этом органе имеется специфическая система захвата и катаболизма продуктов конъюгации, образующихся в печени. Активность других органов, таких как кишечник, селезенка, мышечная ткань, плацента, мозг, кровь - значительно ниже, однако наличие ферментов, катализирующих процессы биотрансформации, при интоксикации ксенобиотиками, имеет ключевое значение в развитии патологических процессов в этих органах. В процессе внепеченочного метаболизма могут образовываться продукты, как аналогичные продуктам печеночного происхождения, так и отличные от них. Иногда в ходе внепеченочного метаболизма может осуществляться активация метаболитов, образующихся в печени.

Часть ферментных систем метаболизма ксенобиотиков локализуются в жидкостях организма. В плазмы крови имеются ферменты, участвующие в гидролизе целого ряда чужеродных веществ, таких как ФОС, некоторые алкалоиды (атропин), лекарственные препараты (новокаин, прокаин) и др.

Некоторые реакции метаболизма катализируются ферментными системами митохондрий и растворимой фракции многих тканей. Как правило, эти же ферменты осуществляют ряд превращений нормального обмена. Однако в основном ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков локализованы внутри клеток печени в эндоплазматическом ретикулуме. Эти структуры существуют во всех животных клетках за исключением эритроцитов.

Методом ультрацентрфугирования гладкий эндоплазматический ретикулум выделяется из гомогената клеток в виде фрагментов мембранных структур, называемых микросомами. Поэтому основная группа ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, получила название «микросомальных ферментов».

143

Первая фаза метаболизма ксенобиотиков. В 1-ой фазе биотрансфор-

мации окислению микросомальными ферментами подвергаются разнообразные по строению органические липидорастворимые соединения. В основе этих реакций обычно лежит гидроксилирование. Реакции гидроксилирования осуществляются рядом сопряженных окислительно-восстановительных этапов, которые в упрощенном виде заключаются в том, что с участием восстановленного никотинадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) и гемопротеида цитохрома Р450 кислород превращает в активную молекулярную форму, а затем активированный кислород гидроксилирует чужеродное соединение с участием различных монооксигеназ.

С точки зрения каталитической активности в отношении огромного числа ксенобиотиков среди ферментов 1-й фазы ведущее место занимает именно система цитохрома Р450. Наибольшая концентрация цитохрома Р450 обнаруживается в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов (микросомах). Печеночные микросомальные цитохромы Р450 играют важнейшую роль в определении интенсивности и времени действия чужеродных соединений и ключевую - в детоксикации ксенобиотиков, а также в активации их до токсичных и/или канцерогенных метаболитов.

Цитохром Р450-зависимые монооксигеназы это мультиферментная электрон-транспортная система. Все цитохромы Р450 - гемсодержащие белки. Обычно гемовое железо находится в окисленном состоянии (Fe3+). Восстанавливаясь до состояния Fe2+, цитохром Р450 способен связывать лиганды, такие как кислород или монооксид углерода. Комплекс восстановленного цитохрома Р450 с СО имеет максимум поглощения 450 нм, что и явилось основанием для названия этих ферментов.

Цитохром Р450 - монооксигеназная система катализируют основную реакцию в которой один атом кислорода взаимодействует с субстратом (RH), а другой восстанавливается до Н2О. В качестве восстановителя в реакции участвует НАДФН:

RH (субстрат) + О2 + НАДФH + H+ → ROH (продукт) + Н2О + НАДФ+

144

Механизм, благодаря которому цитохром Р450 получает электрон от НАДФH, зависит от его внутриклеточной локализации. В эндоплазматическом ретикулуме, где расположено большинство гемопротеидов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков, электрон передается через флавопротеид, называемый НАДФH-цитохром Р450-редуктаза. Одна молекула этого флавопротеида может доставлять электроны на несколько различных молекул цитохрома Р450.

Цитохром Р450 обнаруживается во всех организмах, начиная от бактерий. Полагают, что в процессе эволюции этот фермент появился для превращения (конверсии) инертных углеводородов из окружающей среды до продуктов, используемых с энергетической и пластической целью, либо для удаления токсичных гидроперекисей у примитивных организмов, использующих кислород в клеточном дыхании. В результате процессов дупликации, конверсии, мутации генов образовалось множество изоформ цитохрома Р450, осуществляющих окислительный, восстановительный метаболизм стероидов, жирных кислот, ретиноидов, желчных кислот, биогенных аминов, лейкотриенов, а также экзогенных соединений, в том числе различных лекарственных препаратов и токсикантов.

В настоящее время известно, что цитохромы Р450 млекопитающих представляют собой структурно и функционально различные изоферменты. Они кодируются суперсемейством генов. В 1987 году была разработана классификация Р450, основанная на дивергентной эволюции и гомологии нуклеoтид/аминокислотных последовательностей. Суперсемейство было разделено на семейства, подсемейства и индивидуальные гены. В настоящее время описано 36 семейств генов Р450, из них 12 обнаружено у млекопитающих.

Независимо от структуры и хромосомной локализации, цитохромы P450 подразделяют на конститутивные и индуцибельные изоформы. Конститутивные изоформы Р450 постоянно продуцируются клеткой,

145

независимо от внешних условий. В отличие от конститутивных форм, экспрессия индуцибельных ферментов может вызываться химическими соединениями. Специфическая индукция отдельных форм Р450 – одно из важнейших свойств этих ферментов, приобретенных в процессе эволюции.

Одним из важнейших свойств компонентов монооксигеназной системы, в частности цитохрома Р450, является способность к индукции под действием внешнего стимула, в роли которого могут выступать ксенобиотики, различные стресс-факторы физической и биологической природы. В отдельных случаях экзогенные вещества индуцируют ферменты (в том числе цитохромы Р450) своего метаболизма, что важно иметь в виду при применении лекарственных препаратов, побочным действием которых является индукция ферментов собственного метаболизма. Феномен индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей адаптивного ответа на чужеродные соединения, попадающие в клетку. Это приводит к усилению детоксификационной функции организма с последующим выведением ксенобиотика.

Индукция цитохромов Р450 синтетическими или природными соединениями зарегистрирована у млекопитающих, птиц, рыб, беспозвоночных, растениях, дрожжах и бактериях. Все это свидетельствует о биологической важности этого явления. Эффективными индукторами цитохрома Р450 являются макролидные антибиотики, синтетические стероиды, галогенированные полициклические углеводороды (ПАУ) и др.

Цитохромы Р450 катализируют следующие типы реакций: гидроксилирование алифатического или ароматического атома углерода; окисление атома (S, N, I) или N-гидроксилирование; перенос окисленной группы; разрушение эфирной связи; дегидрогенирование и ряд других реакций.

Основные типы реакцийи микросомального окисления с участием цитохрома Р450 и НАДФН:

1. Гидроксилирование ароматического атома углерода

146

2. Гидроксилирование циклических предельных углеводородов или органических соединений по насыщенной С-Н связи (ациклическое):

3.Гидроксилирование гетероциклических углеводородов:

4.N-оксиление:

5. Окислительное дезаминирование:

Микросомальное восстановление. В микросомальной фракции пече-

ни содержатся ферменты не только окисляющие, но и восстанавливающие чужеродные органические соединения. Последние реакции далеко не так

147

универсальны, как окислительные. Восстановлению подвергаются ароматические нитро- и азо-соединения и алифатические галогенсодержащие соединения.

Предполагаются следующие этапы восстановления, включающие, и неферментативную фазу: 1)микросомальный ферментативный комплекс НАДФ-Н2 – цитохром-в-редуктаза или НАД-Н2 – цитохром-в-редуктаза восстанавливает ФАД (флавинадениннуклеотид) в ФАД-Н2. Последний неферментативно восстанавливает токсическое соединение:

3 ФАД-Н2 + R·NO2 → 3 ФАД + RNН2 + 2Н2О

Немикросомальные реакции окисления, восстановления и гидро-

лиза. Существуют многие ферментные системы, катализирующие превращения как эндогенных, так и экзогенных субстратов. Например, в растворимой фракции гомогенатов печени, почек и легких содержится алкогольдегидрогеназа (АДГ), которая быстро окисляет многие первичные спирты в соответствующие альдегиды (медленно этиленгликоль, но не диэтиленгликоль). Необходимым коферментом этих реакций является НАД или НАДФ и участие цитохрома Р-450:

АДГ

CH3·CH2ОН + НАД ¾¾¾® CH3COH + НАД-Н2

Окисление многих алифатических и ароматических альдегидов в соответствующие карбоновые кислоты выполняют такие ферменты как альдегидоксидазы и ксантиноксидазы:

Альдегидоксидаза

C6H5COH + H2O + НАД ¾¾¾¾® C6H5COOH + НАД-Н2

Известно несколько типов немикросомального восстановления: восстановление двойных связей, дисульфидов, сульфоксидов и др.

Гидролитическому расщеплению подвергаются сложные эфиры и амиды кислот. В этом процессе участвуют ферменты (эстеразы, амидазы), находящиеся в печени и в плазме крови:

148

Эстераза

RСООR' + Н2O ¾¾¾® RCOOH + R'ОН

RСООR' – сложный эфир, RCOOH – кислота, R'ОН – спирт,

Амидаза

RСООNH2 ¾¾¾® RСООН + NН3, где RСООNH2 – амид кислоты, RСООН – кислота

Биотрансформация галогенсодержащих соединений может происходить также путем гидролитического дегалогенизирования в печени и почках с образованием свободных ионов хлора или брома и соответствующих продуктов гидролиза:

CH2Cl·Br ¾® HCOH + Cl– + Br–

Вторая фаза метаболизма ксенобиотиков (реакции синтеза и конъ-

югации). Приобретение продуктами первой фазы биотрансформации химически активных групп (ОН, СООН, NН2, SH и др.) способствует дальнейшей их конъюгации с легкодоступными эндогенными субстратами. Ко второй фазе биотрансформации ксенобиотиков относятся реакции глюкуроновой конъюгации, сульфатирования, ацетилирования, метилирования, конъюгации с глютатионом (синтез меркаптуровых кислот) и конъюгация с аминокислотами, такими как глицин, таурин, глутаминовая кислота. Кофакторы этих реакций реагируют с функциональными ферментами 1-й фазы. За исключением метилирования и ацетилирования, реакции 2-й фазы приводят к значительному увеличению гидрофильности ксенобиотика, что способствует их экскреции из организма. Большинство ферментов 2-й фазы локализовано в цитозоле, кроме уридиндифосфоглюкуронозилтрансфераз (УДТ), которые являются микросомальными. Реакции 2-й фазы обычно протекают намного быстрее, чем реакции 1-й фазы, катализируемые цитохромом Р-450. Поэтому скорость элиминирования ксенобиотика в большой степени зависит от скорости, с которой протекает реакция 1-й фазы.

149

Конъюгирование приводит к образованию более полярной молекулы, легко выделяющейся из организма с мочой. Реакцию конъюгации, как правило, можно рассматривать как истинную детоксикацию многих токсикантов. Как и ферменты 1-ой фазы метаболизма ксенобиотиков, ферменты 2-ой фазы обладают слабой субстратной специфичностью и участвуют в превращениях большой группы химических веществ.

Образование конъюгатов – это сложный биохимический процесс, в основе которого лежит активирование эндогенного субстрата при участии специфических в каждом случае ферментов.

Глюкуроновая конъюгация. Конъюгация с глюкуроновой кислотой наиболее универсальная реакция, характерная для связывания разнообразных ядовитых соединений у всех видов млекопитающих (за малым исключением).

Источником глюкуроновой кислоты является глюкоза или ее предшественники. Глюкоза активируется при участии АТФ (аденозинтрифосфата). Специфическим коферментом при образовании глюкуроновой кислоты слу-

жит уридиндифосфат (УДФ). Синтез b-глюкуронида можно выразить следующей схемой:

Глюкозо-1-фосфат ¾® УДФ-глюкоза ¾¾¾¾¾¾¾®УДФ-глюкуроновая

УДФ-глюкуронозилтрансфераза

кислота + чужеродное соединение ¾¾¾¾¾¾¾® b-глюкуронид + УДФ

В реакцию конъюгации глюкуроновая кислота вступает в активной форме уридиндифосфоглюкуроновой кислоты (УДФГК), которая образуется в процессе взаимодействия глюкозо-1-фосфата с уридинтрифосфорной кислотой (УТФ) в растворимой фракции цитозоля клеток. Далее УДФГК переносится на молекулу-акцептор с помощью соответствующей трансферазы: УДФ-глюк-уронозилтрансферазы (УДФ-ГТ), которая обладает субстратной специфичностью. Этот фермент присутствует в микросомальной фракции клеток печени, почек, других органов. УДФ-ГТ индуцируется при поступлении в организм таких веществ, как фенобарбитал, ПАУ, диоксины,

150