Вопрос 56.
Возбудитель оспы овец, характеристика болезни и вируса, биопрепараты.
Оспу овец (ВОО, Sheeppox virus) относят к особо опасным болезням мелких жвачных животных. Они широко распространены в мире и наносят овцеводству огромный экономический ущерб. Опасность заболевания характеризуется высокой летальностью, которая в зависимости от породы, возраста животных, форм течения болезни, наличия секундарных инфекций может достигать 50-80%. По данным МЭБ оспу овец регистрируют на всех континентах, за исключением Австралии и Океании. В настоящее время оспа овец широко распространена в Алжире, Индии, Ираке, Иране, Китае, Тунисе и ряде других стран . В России оспа эпизодически регистрируется на приграничных территориях (Приморский край), в 2015-2016 годах — в Ярославской области.
Характеристика возбудителя. Установлено, что вирус оспы относится к семейству Poxviridae. Самостоятельными видами являются вирусы: натуральной оспы овец, коз (род Carpipoxvirus). Возбудителями являются ДНК- содержащие вирусы размером 170-350 нм. Вирионы вируса оспы овец имеют овальную форму и размер в пределах 100-200х150-250 нм, покрыты многослойной мембраной с филаментозными выростами. В центре вириона расположен нуклеоид, содержащий ДНК вируса. Вирионы содежат 89-92% белка, 2,8% углеводов, 5-7% липидов и 3-6% ДНК. По морфологическим свойствам отмечено большое сходство вируса оспы овец с другими представителями поксвирусов, особенно с вирусом оспы коз.
Морфогенез вируса представляет собой сложный многоэтапный процесс. В клетку вирус проникает путем виропексиса или фагоцитоза. Формирование вирионов происходит в цитоплазме клетки в зоне виропласта, последующие этапы морфогенеза не представлены.
Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус чувствителен к действию высоких температур. При нагревании до 53° убивает его через 15 минут. Низкие температуры консервируют вирус до двух лет и более. В овчарнях вирус сохраняется до полугода, на пастбище до 62 дней, а в шерсти овец до двух месяцев. При гниении вирус погибает быстро. Замораживание консервирует вирус. Обычные дезинфицирующие препараты (карболовая кислота, хлорная известь, растворы едкого натра, формалин, глутаровый альдегид и другие) быстро инактивируют вирус на объектах внешней среды.
Локализация вируса. Попавший в организм животных вирус приблизительно через четыре дня обнаруживается в крови и в паренхиматозных органах. Продолжается не более 2-3 дней, а затем вирус проникает к эпителиальным клеткам кожи и слизистых оболочек. В местах размножения вируса происходят реактивные изменения типа воспалительного процесса, вначале серозного, а затем гнойного.
Патогенез. Вирус, попадающий в организм с вдыхаемым воздухом, размножается в клетках эпителия дыхательных путей, вызывая типичные изменения. Отсюда он током крови заносится в кожу и слизистые оболочки, в которых вызывает образование оспин. В период вирусемии, когда наблюдается лихорадка, возбудитель обнаруживают в крови, легких и почках.
Источник инфекции. Большую опасность представляют переболевшие овцы, у которых в сухих корках оспин, вирус может оставаться жизнеспособным до нескольких месяцев. При поражении оспой молочной железы вирус выделяется с молоком.
Факторами передачи возбудителя инфекции являются корма, навоз, предметы ухода, загрязненные выделениями больных животных. Переносчиками возбудителя могут быть животные других видов и люди.
Болезнь возникает в любое время года, но особенно тяжело протекает при холодной, сырой погоде. Находясь в клетках негниющих тканей, особенно в сухих кормах, отпавших оспинах в холодное время года возбудитель оспы способен сохранить жизнеспособность месяцами; в темном прохладном месте – до 2 лет.
Наиболее тяжело протекает оспа у овец тонкорунных пород, а также у молодых животных. При этом большое значение имеют условия содержания животных; например, на выпасах в теплую погоду оспа протекает сравнительно легко, при неудовлетворительных условиях содержания болезнь может приобретать злокачественную форму.
Болезнь в хозяйстве (стаде) распространяется в виде эпизоотий. Через 2-4 недели в стаде, если не приняты своевременно меры, зараженными оказываются большинство животных. Летальность при вспышке оспы невысокая до 2-5%.
При оценке эпизоотологических данных необходимо учитывать, что из домашних животных болезнь поражает только овец, независимо от возраста и породы, а из диких – сайгаков и козерогов.
Клинические признаки. Инкубационный период продолжается 3-14 дней. Заболевание начинается с опухания век, из глаз и носа появляется сначала серозно-слизистый, затем серозно-гнойный экссудат. Дыхание у овец становится затрудненным и сопящим. Появляется оспенная сыпь на голове, губах, вокруг глаз, на внутренней поверхности передних и задних конечностей, на мошонке и крайней плоти у самцов, а также на коже вымени и слизистой оболочке срамных губ у самок.
Патологоанатомические признаки. Помимо характерных изменений на коже и слизистых оболочках ротовой полости обнаруживают геморрагическое воспаление слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. В глотке и трахее находят эрозии и язвы. Отмечают увеличение всех поверхностных и регионарных лимфатических узлов. Наблюдают кровоизлияния на серозных покровах; в легких — очаги гепатизации. В срезах папул, окрашенных по Пашену и Романовскому, выявляют элементарные частицы вируса — вирионы возбудителя болезни.
Диагностика. При постановке клинического диагноза начальную стадию болезни дифференцируют от грибковой парши, клещевой чесотки, папулезной (незаразной) экземы и контагиозного пустулезного дерматита овец и коз (эктимы).
Для подтверждения диагноза на оспу необходимо взять материал (участок кожи, имеющие свежие, только что образовавшиеся папулы до их нагноения, пораженные легкие, селезенку, лимфатические узлы, кровь) и направлять в областную ветеринарную лабораторию на исследование в соответствии с действующими методическими указаниями.
Лабораторная диагностика оспы животных включает в себя:
обнаружение в патологическом материале оспенных частиц (вирионов) методом вирусоскопии;
обнаружение цитоплазматических ацидофильных включений в пораженных участках кожи больного или зараженного животного гистологическим методом;
выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) с последующей его идентификацией;
биологическую пробу (в сомнительных случаях) на естественновосприимчивых животных.
Отбор, упаковка и пересылка патологического материала.
Патологический материал отбирают не менее чем с 5 участков пораженной кожи. Для сбора и консервирования материала используют стерильные инструменты, посуду и консервирующие растворы. Материал от больных животных, обработанных моющими или дезинфицирующими растворами (едкого натра и др,), к исследованию не пригоден.
Для исследования в лабораторию направляют:
мазки, сделанные из содержимого везикул больного животного, и мазки-отпечатки с оспенных поражений кожи;
патологический материал от больных животных (содержимое везикул, целые папулы и пустулы, иссеченные
вместе с субэпидермальной отечной тканью).
Мазки высушивают на воздухе, складывая так, чтобы они не соприкасались между собой, и упаковывают в целлофан.
Везикулярную жидкость собирают в капилляры пастеровских пипеток, которые затем помещают в пробирки с резиновыми пробками. Папулы и пустулы иссекают ножницами вместе с отечной тканью и помещают в два стерильных флакона: один — с 50% -ным раствором глицерина, второй — с 10% -ным раствором формалина. Отобранный материал (пробирки и флаконы с патологическим материалом предварительно обрабатывают снаружи 3% -ным раствором хлорамина) упаковывают в металлические коробки или пеналы и направляют с нарочным в лабораторию. Неконсервированный материал доставляют в термосе со льдом в день отбора.
Вирусоскопическое исследование
Для обнаружения вирусных оспенных частиц (вирионов) исследуют мазки и мазки-отпечатки из патологического материала окрашенные по методу Морозова или Пашена.
При микроскопии в препаратах обнаруживают множество мелких частиц кокковидной формы, расположенных поодиночке, парами или в виде скоплений. При окраске по Морозову оспенные частицы имеют темно-коричневый цвет, по Пашену — темно-красный.
Результат исследования считают положительным только при обнаружении вирионов в массовом количестве (в виде россыпей). При отрицательном результате вирусоскопического исследования, а также при обнаружении единичных вирионов проводят дальнейшие исследования.
Патогистологические исследования
Из фиксированных формалином проб кожи на замораживающем микротоме готовят срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином. При исследовании папул в дерме находят гиперемию, серозный отек и клеточный пролиферат, состоящий
из лейкоцитов, гистиоцитов (макрофагов) и фибробластов, в эпидермисе — гиперплазию и некроз кератоцитов.
В везикулах обнаруживают скопление серозного экссудата или полиморфноядерных лейкоцитов, лизис клеток дермы, в пустулах — наличие гнойных телец. При оспе в эпителиальных клетках эпидермиса, а у овец и коз также в гистиоцитах сосочкового слоя дермы находят цитоплазматические ацидофильные включения.
Патологогистологический диагноз на оспу овец считают положительным при обнаружении, кроме вышеописанных изменений, внутриядерных вакуолей в гистиоцитах собственно кожи (дермы) овец.
Оспу овец дифференцируют от контагиозного пустулезного дерматита, при котором устанавливают гиперкератоз, пролиферацию эпителия волосяных фолликулов, а также ацидофильные цитоплазматические изменения в кератиноцитах эпидермиса.
Выделение возбудителя на куриных эмбрионах
Пробы исследуемого материала растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе (pH 7,2 - 7,4).
Если патматериал консервирован глицерином, его предварительно отмывают физиологическим раствором.
Суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, добавляют к ней антибиотики (из расчета 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 60 ЕД/мл нистатина); выдерживают при 4°С 12 ч. Надосадочную жидкость проверяют на бактериальную загрязненность. При отсутствии в течение суток роста микрофлоры в МПБ и на МПА ее используют для заражения куриных эмбрионов.
Для заражения эмбриона в скорлупе пробойником делают отверстия в центре пуги и сбоку в бессосудистой зоне. Через боковое отверстие на ХАО вводят по 0,2 мл надосадочной жидкости в разведении 1:10,1:100 и 1:1000 (по 4 эмбриона на каждое разведение). После введения исследуемую жидкость равномерно распределяют на ХАО осторожным покачиванием яйца. Затем отверстия в скорлупе заклеивают лейкопластырем, яйца укладывают на бок вверх заклеенным отверстием. Для контроля оставляют незаряженными 4 КЭ. Эмбрионы инкубируют при 34,5...35°С в течение 5 сут, ежедневно просматривая. Гибель эмбрионов в первые сутки считают неспецифической. Эмбрионы, погибшие в более поздние сроки, отбирают, охлаждают и вскрывают. По истечении пяти суток инкубации вскрывают все оставшиеся эмбрионы. Вскрытие КЭ проводят в стерильных условиях. Пинцетом в месте заражения удаляют скорлупу и глазными ножницами иссекают всю пораженную часть ХАО, которую затем промывают в физиологическом растворе, помещают в чашку Петри и просматривают с помощью лупы на черном фоне на наличие оспенных поражений. При наличии в патматериале вируса осповакцины к 72-му часу после заражения на ХАО образуются плоские беловатого цвета оспины диаметром 3 - 4мм. Из пораженных участков ХАО делают мазки для обнаружения частиц вируса оспы методом серебрения по Морозову или окраски по Пашену. При отсутствии специфических поражений на ХАО, суспензией из ХАО делают второй пассаж на КЭ. Вирусы оспы овец и коз на ХАО не вызывают образования специфических изменений.
Биологическая проба
Биологическую пробу проводят на лабораторных или естественновосприимчивых животных, взятых из благополучных по инфекционным болезням хозяйств. Исследования на оспу овец (коз) проводят на двух клинически здоровых ягнятах (козлятах) в возрасте 2 - 3 мес., взятых от неболевших и невакцинированных против оспы маток.
Кожу вентрального бесшерстного участка хвоста подопытных животных обрабатывают 70°-ным этиловым спиртом, затем шприцем внутрикожно в два участка вводят по 0,2 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии (в разведениях 1:20 и 1:200). Биопробу на оспу считают положительной при появлении у ягнят (козлят) на 6 - 8-й день после заражения характерных оспенных розеол, папул и пустул.
Срок исследования: вирусоскопического — 1 день; гистологического — 3 - 4 дня; выделения возбудителя — 6 - 12 дней; биопробы — 9 дней.
Метод обнаружения и дифференциации каприпоксвирусов, основанный на мультиплексной ПЦР с видоспецифичными праймерами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод диагностики, основанный на многократном копировании избранного участка ДНК в
искусственных условиях под воздействием ферментов.
ПЦР базируется на принципе естественной репликации ДНК. Сущность метода ПЦР заключается в выделении специфических конкретных участков ДНК с использованием соответствующих праймеров и многократного их воспроизведения (амплификации) при помощи фермента ДНК-полимеразы. Количество фрагментов ДНК при этом увеличивается в геометрической прогрессии.
Анализ полных нуклеотидных последовательностей генома каприпоксвирусов, представленный в базе данных GenBank, установил видоспецифичные участки для ВОО, ВОК и вируса бугорчатки (ВБ), на основе чего для видовой дифференциации каприпоксвирусов были сконструированы видоспецифичные праймеры:
S1 и S2 - для ВОО,
G1 и G2 - для ВОК.
L1 и L2 - для ВБ (входит в род каприпоксвирусов; поражает преимущественно КРС, но описаны случаи, когда он вызывал заболевание у овец и коз, поэтому была введена третья пара праймеров специфичных для вируса бугорчатки, чтобы метод был логически законченным).
Видоспецифичные праймеры рассчитаны таким образом, чтобы синтезируемые с их участием ампликоны имели разную длину: 415 п.н. для ВОК, 311 п.н. для ВОО и 254 п.н. для ВБ. Это позволило использовать все три пары праймеров в одной реакции и различать продукты мультиплексной ПЦР по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле. Для увеличения аналитической чувствительности метода система была дополнена двумя внешними родоспецифичными праймерами C1 и C2, универсальными для всех трех видов каприпоксвирусов.
Метод дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов BOO и ВОК
Метод позволяет отличать вакцинные штаммы ВОО от эпизоотических изолятов и одновременно с этим дифференцировать ВОО от ВОК, то есть может служить дополнением к методу видовой дифференциации каприпоксвирусов, основанному на мПЦР. Для специфической профилактики оспы овец и коз используются аттенуированные вакцины, поэтому при обнаружении у вакцинированных животных вируса оспы возникает необходимость определить его принадлежность к вакцинному или эпизоотическому штамму.
Непрямой вариант ИФА для обнаружения антител к каприпоксвирусам в сыворотках крови овец и коз на основе рекомбинантных антигенов Р17 и Р18 ВОО
Непрямой ИФА обычно используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью
антиглобулинового конъюгата.
Иммунитет и специфическая профилактика. Переболевшие животные приобретают иммунитет не менее чем на 2 года. Для специфической профилактики оспы овец применяют культуральную вирус-вакцину из аттенуированного штамма НИСХИ, которая создает у привитых животных иммунитет длительностью до 12мес.
Профилактика. Для предупреждения возникновения оспы овец необходимо: 1) не допускать ввода (ввоза) в хозяйство овец, а также кормов и инвентаря из хозяйств, неблагополучных по оспе овец; 2) всех вновь поступивших в хозяйство овец содержать изолированно в течение 30 дней; 3) поддерживать в надлежащем ветеринарно-санитарном состоянии пастбища, места поения, животноводческие помещения; 4) овцепоголовье хозяйств и населенных пунктов, находящихся в угрожаемой по оспе овец зоне, необходимо регулярно прививать противооспенной вакциной.
Лечение. Специфические средства лечения больных оспой овец не разработаны.