22

роста [5], что согласуется с локализацией мерлина в области плотных контактов и подтверждает его участие в контроле пролиферации и контактном торможении роста. Снижение экспрессии NF2 ведет к возникновению дефектных кадгеринопосредованных клеточных контактов [5]. Все эти исследования подтверждают взаимодействие мерлина с актиновым цитоскелетом, несмотря на отсутствие у этого белка актин-связывающего участка на С-конце. Действительно, в 2001 г. было показано, что актин связывается с N-концевым доменом мерлина [45, 46]. Также взаимодействие мерлина с актиновым цитоскелетом может осуществляться с помощью промежуточных белков – спектрина, паксиллина или белков ERMсемейства [47-51]. Еще одним доказательством служат существенные изменения кортикального актинового скелета в шванновских клетках и кератиноцитах, дефектных по NF2 [5, 52]. Значительные дефекты актинового цитоскелета наблюдаются в клетках всех опухолей, возникающих при НФ II [53].

Помимо участия в перестройке актинового цитоскелета, мерлин, повидимому, связан и с движением клетки, обеспечиваемым актиновыми волокнами. У мышей с направленными мутациями в гене Nf2 развиваются злокачественные опухоли, обладающие высокой способностью к метастазированию [53].

Роль белка мерлин в контактном торможении клеточного роста

Известно, что клетки, нокаутные по гену NF2, не испытывают контактного торможения клеточного роста [5, 33, 54]. Неконтролируемый рост – это наиболее заметное и совершенно очевидное последствие утраты мерлина в любых клетках [5]. Не вполне ясно, каким образом мерлин регулирует клеточный рост. Одним из возможных механизмов является его взаимодействие с кадгеринами в области клеточных контактов. Мерлин связывается с Е-кадгерин-β-катениновым комплексом и таким образом накапливается в области плотных контактов в фибробластах и кератиноцитах [5] (рис. 5).

Рисунок 5 «Колокализация мерлина и b-катенина в области десмосом»

23

Недавно в исследованиях на дрозофиле было показано, что мерлин действует совместно с еще одним FERM-содержащим белком, Expanded [55, 56]. Expanded ингибируется белком Fat, предшественником кадгерина [57], который связывает Expanded и удерживает его на плазматической мембране [16]. Таким образом, кадгерины и прокадгерины предположительно контролируют локализацию мерлина и Expanded в области плотных контактов. Будучи закрепленным на десмосомах, мерлин стабилизирует эти структуры, локально подавляя сигнализацию от RAC [5, 16] (рис. 6).

Рисунок 6 «Мерлин и сигнальный путь Хиппо (WNT) у дрозофилы и млекопитающих»

24

Еще одним потенциальным механизмом торможения роста является взаимодействие мерлина с рецептором гиалуроновой кислоты CD44 [33]. Мерлин, подобно остальным членам ERM-семейства, способен связываться с цитоплазматическим доменом CD44. Предположительно, мерлин, находясь в открытой конформации, образует с остальными белками ERM-семейства гетерогенные комплексы, являющиеся митогенами. В клетках, достигших конфлуэнтности, или контактирующих с гиалуроновой кислотой, мерлин выходит из состава комплекса, связывается с CD44 и ингибирует клеточный рост [33]. Однако утрата CD44 не оказывает такого же эффекта, как потеря мерлина, на фибробласты, достигшие монослоя, из чего следует, что CD44 не являтся необходимым звеном контактного торможения роста [5].

Недавние исследования показали, что р-21-активируемые киназы (РАК) не только играют важную роль в регуляции мерлина, но и являются его основными мишенями. В норме мерлин ингибирует РАК, а его утрата приводит к избыточной активации РАК с последующим запуском сигнальных путей, отвечающих за усиленный клеточный рост (рис. 5). Тем не менее, доподлинно неизвестно, насколько велик вклад активации РАК в изменения клеточного роста в NF2- клетках [58].

Рисунок 7 «Взаимодействие белка мерлин с p21-активируемыми киназами»

25

Механизмы контактного торможения роста не вполне ясны, но, повидимому, межклеточные взаимодействия и клеточные контакты вносят существенный вклад в рост и распространение опухоли в NF2-дефектном организме [59].

Cигнальные пути с участием мерлина и его онкосупрессорная функция

Мерлин участвует в регуляции множества сигнальных путей, включая активацию Rac, взаимодействие с CD44, HRS (HGF-regulated kinase substrate,

субстрат тирозин-киназы, регулируемой фактором роста гепатоцитов), фактором регуляции натрий-протонного обмена, спектрином βII и многими другими, однако, функции мерлина до сих пор не ясны [58]. Были проведены исследования, в которых в опухолевых клетках, дефектных по гену NF2, восстанавливалась экспрессия мерлина посредством аденовирусной инфекции гена. В результате клетки останавливались в G1-фазе клеточного цикла, что сопровождалось снижением экспрессии циклина D1, ингибированием CDK4 и дефосфорилированием ретинобластомного белка (pRB) [53]. И наоборот, выключение при помощи РНК-интерференции NF2 в нормальных клетках приводило к повышению уровня циклина D1 и инициировало переход в S-фазу. Возможно, эксперименты с выключением экспрессии циклина D1 помогут объяснить влияние мерлина на пролиферацию, однако пока не ясно, какие посредники обеспечивают взаимодействие мерлина и циклина D1 [53].

Одними из ключевых эффекторов мерлина являются малые ГТФазы семейства RAC (Ras-related C3 botulinum toxin substrate) [60, 61]. Роль активации

RAC в канцерогенезе хорошо изучена [62-64]. Активирующие мутации в генах RAC обнаружены в клетках меланомы [65-67], немелкоклеточного рака лёгких [68, 69], рака печени [70] и метастазирующего рака молочной железы [71, 72]. Основными клеточными эффектами RAC являются усиление интегринопосредованного движения и, как следствие, активация пролиферативного

26

каскада PI3K – AKT [73], что обусловливает инвазивность RAC-зависимых опухолей.

При помощи коиммунопреципитации было выявлено множество белков, взаимодействующих с мерлином. Большинство из них входит в состав комплексов молекул адгезии с рецепторами факторов роста или участвует в везикулярном транспорте [16].

Таблица 1 «Белки, взаимодействующие с мерлином» [16]

Ни один из этих белков не взаимодействует с закрытой, дефосфорилированной формой мерлина. Также нет данных, позволяющих утверждать, что эти белки необходимы для осуществления онкосупрессорной функции мерлина. Однако все эти пути ведут так или иначе к подавлению пролиферации или активации апоптоза [16].

Также важным взаимодействием мерлина является его связывание с HRS [74]. HRS содержит FYVE-домен, связывающий эндосомальный фосфатидилинозитол-3-фосфат (PI3P), и участок, взаимодействующий с убиквитином [75-77]. HRS – мощный регулятор транспорта убиквитинилированных рецепторных тирозин-киназ (RTK) в лизосомы [77-79]. Мерлин колокализован с HRS на эндосомах и, по-видимому, принимает участие в обороте RTK [74]. Мерлин, совместно с HRS, ингибирует STAT (signal transducers and activators of transcription) и STAM (signal transducing activator molecule) –

28

активатор Янус-киназ [80, 81]. Это приводит к угнетению синтеза ДНК и остановке пролиферации [82].

Наконец, недавние исследования выявили ещё два мощных эффектора мерлина, взаимодействие с которыми оказывает огромное влияние на клетку – MTOR (белок-мишень рапамицина у млекопитающих) [83, 84], и убиквитинлигазу семейства E3 CRL4 [85]. В 2009 г. James et al. и Lopez-Lago et al. удалось связать утрату белка мерлин с активацией интегринов и комплекса MTORC1 [83, 84]. Lallemand et al. в 2009 и Ammoun и Hanemann в 2011 доказали, что мерлин напрямую и через взаимодействие с интегринами взаимодействует с рецепторными тирозин-киназами, включая PDGFR (platelet-derived growth factor receptor, рецептор тромбоцитарного фактора роста) и VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor, рецептор эндотелиального фактора роста) [86]. Чуть ранее, в 2008 г., Ammoun et al. показали выраженную активацию MEK, ERK и AKT в клетках, утративших ген NF2 [87]. Приведённые данные позволяют говорить о двух главных сигнальных промитотических каскадах, активирующихся с утратой мерлина: RAS/RAF/MEK/ERK и PI3K/AKT.

Ещё одним крупным открытием, изменившим представления о функциях и регуляции мерлина, стало показанное в 2009 г. в лаборатории д-ра Джанкотти

(Filippo Giancotti) взаимодействие мерлина с CRL4 (Cullin-RING ubiquitin ligase 4,

убиквитинлигаза, содержащая куллин и цинковый палец, 4) – убиквитинлигазой семейства E3 [85]. Было показано, что мерлин напрямую связывается с убиквитинлигаза-ассоциированным фактором 1 (DCAF1), который является субстрат-связывающим агентом для CRL4. Мерлин в активной (закрытой) конформации способен транслоцироваться в ядро и связываться с комплексом CRL4 DCAF1, подавляя его активность (рис.8). Мутации, приводящие к утрате или нарушению активности мерлина, вызывают перманентную активацию CRL4, которая играет важную роль в стабилизации генома, регуляции клеточного цикла и метилировании гистонов. По современным представлениям, активация CRL4 – одно из ключевых звеньев гиперпролиферации NF2-отрицательных клеток, которое может быть скомпенсировано выключением экспрессии DCAF1.

29

Рисунок 8 «Дополненная схема регуляции мерлина»

Современные подходы к поиску терапии НФ II

Лечение НФ II представляет чрезвычайно сложную задачу. Генная терапия данного заболевания, как и любого заболевания, связанного с утратой онкосупрессора, невозможна. Поскольку пациент гетерозиготен по гену NF2, а опухоли развиваются из клеток, в которых произошла инактивация имеющегося аллеля, задача генной терапии сводится к равномерному и умеренному (избыточная экспрессия мерлина приводит к аресту клеточного роста и клеточной гибели) распределению недостающего онкосупрессора по всем тканям организма. Подобная операция возможна только на эмбриональной стадии развития, т е, на

30

стадии, когда ещё невозможна постановка диагноза. Фармакологический подход к лечению НФ II также представляет большие трудности. В связи с доброкачественной природой и, следовательно, медленным ростом опухолей, ассоциированных с НФ II, традиционные цитостатики оказались неэффективными

вотношении этого заболевания. Попытки селективного воздействия на NF2- отрицательные клетки сводятся к выключению отдельных звеньев тех или иных пролиферативных каскадов, подавляемых мерлином. Так, Ammoun et al. в 2011 в исследованиях in vitro показали, что нилотиниб, ингибитор PDGFR, замедляет рост NF2-отрицательных шванном [88]. Ингибитор EGFR эрлотиниб (торг. назв. тарцева) и ингибитор EGFR/ERBB2 лапатиниб (торг. назв. тайверб, тайкерб) также оказались эффективны в отношении вестибулярных шванном [6, 89]. Поскольку в вестибулярнх шванномах, развивающихся у пациентов с НФ II, показано усиление ангиогенеза, была осуществлена успешная попытка применить ингибитор рецепторов VEGFR бевацизумаб, подавляющий ангиогенез [7]. Также,

виспытаниях на клеточной и мышиной моделях НФ II успешными оказались ингибиторы белка-мишени рапамицина MTOR сиролимус (рапамицин) и

эверолимус (Rad001) [90].

Однако трудность заключается в том, что мерлин регулирует множество сигнальных путей с перекрывающимися эффектами. Результатом активации этих каскадов в конечном итоге является усиление экспрессии генов MYC, FOS и JUN и, следовательно, ускорение пролиферации. Выключения какого-то одного сигнального пути недостаточно для подавления пролиферации, вызванной утратой мерлина, т. к. положительное воздействие сводится на нет за счёт активности остальных каскадов. Поэтому в последнее время исследователи склоняются к идее комбинированной терапии. Например, сорафениб (торг. назв.

нексавар), ингибитор PDGFRβ и RAF, замедляет in vitro рост первичных клеток шванномы [87]. В 2009 г. James et al предложили использовать NVP-BEZ235, ингибитор MTOR и PI3K/AKT [84]. Тем не менее, даже одновременное выключение двух каскадов может быть недостаточно эффективным для борьбы с NF2-отрицательными опухолями [84]. Очевидно, требуется более

31

«универсальная» мишень для фармакотерапии. В связи с открытием взаимодействия мерлина с CRL4DCAF1, исследователи надеются, что СRL4 может стать такой мишенью. Так, в 2011 г. Brooks, C.L. and Gu, W. начали эксперименты по ингибированию протеасом, функцией которых является деградация белков, убиквитинилированных лигазой CRL4, в NF2-отрицательных клетках [91].

Другая проблема, затрудняющая разработку фармакотерапии, связана со спецификой эффекторов мерлина. Выключение сразу нескольких пролиферативных каскадов связано с большим количеством побочных эффектов, т. к. те же каскады отвечают и за пролиферацию нормальных клеток. Прямое ингибирование малых ГТФаз RAC, являющихся одними из важнейших регуляторов и эффекторов мерлина, невозможно, т. к. для ГТФаз константа диссоциации субстрата составляет порядка 10-8 – 10-11М [92] (например, для киназ это число составляет 10-6М), и практически невозможно создать конкурентный ингибитор с бόльшим сродством. Альтернативно проводятся эксперименты с ингибиторами PAK, другой группы важных эффекторов и регуляторов мерлина, одновременно являющихся активаторами RAC. В настоящее время многие фармацевтические ведут поиск в этом направлении: например, разработаны конкурентный ингибитор РАК групп I и II PF-3758309 (Пфайзер), конкурентный ингибитор РАК группы I FRAX-597 (Афракса), специфический металлоорганический ингибитор РАК1 Fl-172 и аллостерический ингибитор РАК группы I IPA-3 [93]. Из перечисленных соединений IPA-3 и Fl-172 не были одобрены к клиническим испытаниям из-за высокой токсичности. PF-3758309 был снят с первой фазы клинических испытаний в связи с неудовлетворительными показателями фармакокинетики [94]. FRAX-597 ингибирует широкий спектр рецепторных тирозин-киназ, что приводит к нежелательным побочным действиям [93], однако успешные испытания на животных позволяют надеяться, что более селективные аналоги этого соединения окажутся мощными фармакотерапевтическими препаратами для борьбы с РАКзависимыми формами рака, в т. ч., НФ II.

32

Тем не менее, описанные трудности с лекарственным воздействием на пути, регулируемые мерлином, заставляют искать принципиально новый подход к фармакотерапии НФ II.

Злокачественная трансформация и изменения клеточного метаболизма

Помимо изменений в протеомике раковых клеток (активации промитотических каскадов и угнетения апоптоза) были также показаны серьёзные сдвиги метаболизма, происходящие при злокачественной трансформации клеток. Известно, что энергетический метаболизм раковых клеток зависит от аэробного гликолиза, синтеза жирных кислот и глютаминолиза [95]. Потенциально, эти отличия от нормальных клеток могут быть использованы для создания селективных фармакопрепаратов против рака.

Зависимость раковых клеток от аэробного гликолиза была впервые описана Отто Варбургом (Otto Heinrich Warburg) в 1956 г. Варбург заметил, что в опухолевых клетках уровни гликолиза аномально высоки, и лишь малая часть поступающей в клетку глюкозы окисляется митохондриями. Варбург сделал ввод, что раковые клетки предпочитают аэробный гликолиз окислительному фосфорилированию, и поэтому опухоли становятся «глюкозными ловушками» [96]. Хотя молекулярные механизмы подобного сдвига неясны, исследователи признают, что этот эффект, получивший название «эффекта Варбурга» необходим для поддержания ракового фенотипа клетки [97]. Повышенный захват глюкозы клетками опухоли позволяет использовать для диагностики рака позитронноэмиссионную томографию с 2-F18-2-дезоксиглюкозой [98].

Две другие метаболические характеристики, отличающие раковые клетки от нормальных – это повышенные уровни синтеза жирных кислот и метаболизма глютамина. Ускоренние синтеза жирных кислот может быть связано с повышенной потребностью в липидах для синтеза клеточных мембран быстро делящихся клеток [99]. Раковые клетки также очень чувствительны к снижению уровня глютамина в среде, несмотря на то, что глютамин не является

33

незаменимой аминоксилотой и может быть синтезирован из глюкозы. Зависимость от глютамина не может быть объяснена только его ролью донора азота. Напротив, показано, что глютамин имеет важное значение для захвата аминокислот раковыми клетками [100]. Но важнейшая роль глютамина в раковой клетке – это продукция энергии путём глютаминолиза [101].

Нормальные клетки используют ровно столько энергии и строительных веществ, сколько необходимо для поддержания стабильного состояния. Потребление ресурсов и продукция энергии сверх этого базового уровня требует внешней стимуляции, например, факторами роста [97]. Раковые клетки не нуждаются в такой стимуляции и способны неограничено потреблять вещества, содержащиеся во внутренних средах организма. Получаемую благодаря гликолизу и глютаминолизу энергию эти клетки используют для поддержания высокой скорости пролиферации.

Метаболические характеристики, присущие раковым клеткам, позволяют им эффективно превращать доступные ресурсы в биомассу практически в неограниченных количествах. Этот метаболический сдвиг снимает ограничения роста, свойственные нормальным клеткам, но также и предоставляет возможность отличить трансформированные клетки от здоровых [98]. В этих различиях может крыться подход к селективному лечению злокачественных новообразований. Также, есть данные, указывающие на связь метаболического сдвига с лекарственной устойчивостью. Известно, что вещества, воздействующие на изменённый клеточный метаболизм, могут повышать эффективность противоопухолевых препаратов и снижать лекарственную устойчивость раковых клеток [97].

Лекарственная устойчивость представляет наибольшую трудность в терапии онкологических заболеваний. Понимание механизмов этого явления позволило бы улучшить прогнозы при многих онкологических диагнозах.

Классические противоопухолевые препараты могут быть разделены на несколько подклассов [98]:

34

1.ЛС, влияющие на репликацию ДНК (универсальные противоопухолевые препараты)

•Алкилирующие агенты (цисплатин, темозоломид)

•Антиметаболиты (гемцитабин, 5-фторурацил)

•Алкалоиды растительного происхождения и прочие препараты природного происхождения (винкристин, этопозид)

Препараты, стабилизирующие тубулин (паклитаксел)

•Противоопухолевые антибиотики и родственные препараты

Препараты, стабилизирующие топоизомеразу II (доксорубицин, адриамицин)

•Соединения платины (цисплатин, карбаплатин)

2.ЛС, ингибирующие рецепторы – активаторы пролиферативных каскадов (применяются избирательно при определённых видах злокачественных новообразований)

•Антиэстрогены (тамоксифен, ралоксифен) – ЭР-положительный рак молочной железы [102]

•Ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста ERBB1 и ERBB2 (лапатиниб, трастузумаб) – ЭР-положительнй метастазирующий рак молочной железы [103], рак желудка [104], серозная папиллярная карцинома эндометрия [105]

•Ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста ERBB1 (цетуксимаб, панитумумаб) – колоректальный рак [106], немелкоклеточный рак лёгкого [107], рак головы и шеи [108]

•Ингибитор рецепторов эндотелиального фактора роста (бевацизумаб)

– колоректальный рак, немелкоклеточный рак лёгкого, глиобластома, ренальная карцинома (NCI, 2006)

•Молоклональные антитела к В-лимфоцитарному антигену CD20 (ритуксимаб) – неходжкинская лимфома [109]

35

Появляется всё больше данных, свидетельствующих о вкладе изменённого метаболизма в развитие лекарственной устойчивости опухолей [110, 111], [112]. Например, лактатдегидрогеназа А (ЛДГА) влияет на устойчивость клеток рака молочной железы к терапии паклитакселом и трастузумабом, киназа пируватдегидрогиназы 3 (ПДК 3) играет роль в обусловленной гипоксией лекарственной устойчивости колоректального рака и рака шейки матки [98]. Показана роль синтазы жирных кислот (СЖК, FASN) в приобретённой устойчивости клеток рака молочной железы к терапии докситакселом, трастузумабом и адриамицином, а также первичной устойчивости к гемцитабину и лучевой терапии при раке поджелудочной железы [98]. Наконец, глютаминолиз является важным звеном устойчивости к цисплатину, обусловленной активацией косплекса mTORC1, при раке желудка [98].

Был проведён ряд исследований in vitro и in vivo, подтвердивший синергизм модуляторов метаболизма с некоторыми противоопухолевыми препаратами (табл.

2)

Таблица 2 «Положительный эффект модуляторов метаболизма при использовании противоопухолевых препаратов» [98]

36

В настоящее время нет данных, указывающих на изменения метаболизма в клетках доброкачественных опухолей, однако, если бы подобные изменения удалось выявить, то модуляторы метаболизма могли бы стать новым оружием в борьбе с медленно растущими доброкачественными новообразованиями.

37

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеточных линий. Иммортализованные клетки мышиной Nf2-отрицательной шванномы (SC4-9), иммортализованные мышиные шванновские клетки FС912 (дикого типа) и FH912 (Nf2-отрицательные), и первичные мышиные эмбриональные фибробласты, несущие флокс-аллель в гене Nf2 (MEF Nf2flox/flox) были любезно предоставлены д-ром Марко Джованнини (dr

Marco Giovannini, Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) et Institut

Universitaire d’Hematologie, Paris, France). Клетки крысиной Nf2-отрицательной шванномы (RT4) были получены из Американского банка клеток и тканей (ATCC,

кат. № CRL-2768).

Все клеточные линии, кроме FС912 и FH912, выращивали в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мM L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 0.1 мМ смеси заменимых аминокислот (все Gibco Invitrogen Ltd, Paisley, UK) при 370С, 5% СО 2. Клетки линий FС912 и FH912 выращивали в среде DMEM:F12 (1:1) с добавлением 2 мкM форсколина, 10 нг/мл нейрегулина и добавки N2 в рекомендованной производителем концентрации начашках, обработванных полилизином и ламинином. Клеточные линии растили на 10-см чашках Петри. Все клеточные линии вели не более 30 пассажей.

Клетки MEF Nf2flox/flox иммортализовали, трансфецировав их плазмидой pMSE-SV40LT (ранее получена в лаборатории д-ра Jonathan Chernoff), как описано в [113].

Для экспериментов по тестированию биоактивных веществ (построения кривых Концентрация/Эффект) клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 104 клеток/лунку. Для вестерн-блоттинга клетки высевали в 6- луночные планшеты в концентрации 2,5х105 клеток/лунку, через 4 часа после пересева среду заменяли на бессывороточную. Для выделения мРНК для количественной ПЦР клетки растили в 6-см чашках Петри до достижения

38

монослоя. Для УВЭЖХ-МС/МС клетки растили в 30-см чашках Петри до достижения монослоя.

Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2. Иммортализованные

MEF Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-Cre-GFP построенной на базе ретровирусного вектора MSCV и несущей Cre-рекомбиназу и зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP). Контрольные MEF

Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-GFP (обе плазмиды получены ранее в лаборатории д-ра Jonathan Chernoff), несущей только GFP. Через 48 часов после трансфекции на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson FACS-VantageSE flow cytometer) отбирали флуоресцентные клетки. Через 2 недели трансфекцию и цитофлуориметрию повторяли.

Геномное типирование. Выделение геномной ДНК из культуры клеток осуществляли с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ, как описано в [114].

Геномное типирование проводили методом, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для реакции были использованы праймеры P5 (5’- GAAGGCAGCTTCCTTAAGTC-3’) и P6 (5’-CCTCTATTTGAGTGCGTGCCATG-

3’), фланкирующие область гена Nf2, ограниченную флокс-сайтами, и праймер P4 (5’-CTTCCCAGACAAGCAGGGTTC-3’), специфичный для участка между двумя флокс-сайтами [115]. Генотипы определяли по наличию или отсутствию продукта амплификации при использовании той или иной пары праймеров.

Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ (NH4)2SO4, 1мM MgSO4, 0,2мM дНТФ, 10 пмоль каждого праймера, 0,5 ед. Taqполимеразы (ThermoPol, Biolabs Inc., США) и 100 нг геномной ДНК. Реакцию ставили в стеклянных капиллярах на приборе 1605 Air ThermoCycler (Idaho Technologies), программа амплификации: 50 циклов (10 с - 94°С; 1 с - 62°С; 30 с - 72°С). Подукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1%-

39

ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Изображение визуализировали с помощью UVP ImageSystem.

Определение уровня пролиферации и выживаемости клеток. Уровень пролиферации и выживаемости клеток оценивали по образованию солей тетразолия (модифицированный МТТ-тест) используя набор Premixed WST-1 Cell Proliferation Reagent (ClonTech, США) согласно протоколу, рекомендованному фирмой-производителем.

Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ. В

работе использована коллекция ICCB Known Bioactives (Enzo Life Sciences, США, № BML-2840-0100) [18]. В коллекции представлены лиганды рецепторов, сопряжённых с G-белками; лиганды ядерных рецепторов; модуляторы актина и тубулина; модуляторы вторичных мессенджеров; модуляторы генной экспрессии; блокаторы ионных каналов; ингибиторы киназ, протеаз и дифосфоэстераз; ингибиторы липидного синтеза и др., в т. ч., адреномиметики (4), альфа- и бетаадреноблокаторы (2), холинергические и антихолинэстеразные препараты (14), регуляторы серотонинергических и дофаминергических процессов (4), нестероидные противовоспалительные препараты (8), кортикостероиды (2), простагландины и производные арахидоновой кислоты (40), активаторы и блокаторы калиевых каналов (13), агонисты и антагонисты ионов кальция (30), блокаторы натриевых каналов (12), эстрогены и антиэстрогены (3), антибиотики различных классов (7), цитостатики (15), иммуномодуляторы (3), индукторы апоптоза (37) в виде растворов в диметилсульфоксиде (ДМСО).

Скрининг был осуществлён на двух клеточных линиях: экспериментальной MEF Nf2-/- и контрольной MEF Nf2flox/flox, в трипликатах, и повторён дважды. Перенос веществ в планшеты с клетками осуществлялся с помощью прибора CyBi Well Vario (CyBio, США), объём переноса – 100 нл. Перенос осуществляли через 4 часа после посева клеток. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель (ДМСО). В качестве положительного контроля использовали

40

стауроспорин в конечной концентрации 20 мкмоль. После 48-часовой инкубации с биоактивными веществами оценивали уровень выживаемости клеток с помощью модифицированного MTT-теста. Веществами, показавшими положительный результат, считали такие, для которых соотношение жизнеспособных клеток MEF Nf2-/- к MEF Nf2flox/flox было < 0,8, расценивая разницу в 20% как умеренные различия, a ожидаемая доля ложных отклонений гипотез (FDR, false discovery rate) по методу Бенджамини-Хохберга [19] < 20%

Трансфекции проводили методом электропорации с помощью прибора Neon (Invitrogene, США) согласно протоколу, рекомендованному фирмойпроизводителем. После электропорации клетки высевали на 10-см чашки в концентрации 4*106 клеток/чашку. Трансфекцию осуществляли, используя 5 мкг ДНК на реакцию или миРНК в конечной концентрации 100 нМ.

Реэкспрессия белка мерлин в Nf2-отрицательных клетках. Клетки линии SC4-9 трансфецировали плазмидой pEGFP-NF2 (ранее получена в лаборатории д-ра Чернова, Chernoff Lab, Fox Chase Cancer Center), кодирующей белок-фьюжн мерлин-GFP. В качестве контрольных использовали клетки SC4-9, трансфецированные плазмидой pEGFP. Эффективность трансфекции оценивалась визуально по соотношению GFP-положительных и GFP-отрицательных клеток и составляла ~ 40%. Уровень экспрессии белка мерлин оценивался методом иммуноблоттинга.

Иммуноблоттинг. Лизаты клеток получали, обрабатывая клетки буфером RIPA (1% Triton-X100, 10% глицерин, 50мM HEPES, pH 7,4, 150мM NaCl, 1,5мМ MgCl2, 1мМ EGTA, 1мМ EDTA, 0,1%SDS, 10мМ фенилметилсульфонил-фторид, апротинин 10µг/мл, лейпептин 10µг/мл, пепстатин 10µг/мл, 10мМ ортованадат натрия) в течение 15 мин. при +40 С. Присутствие специфических белков определяли с помощью стандартного иммуноблоттинга, используя первичные моноклональные антитела: мышиные анти-Merlin (Abcam, США, № ab88956) и

41

анти-β-Actin (Santa Cruz, США, № SC-130301) и кроличьи анти-Casp3 антиGAPDH (Cell Signaling Technology, США, № № 9579 и 5174S). Для определения ферментов, участвующих в липогенезе, использовали набор первичных моноклональных кроличьих антител Fatty Acid and Lipid Metabolism Antibody Sampler Kit (Cell Signaling Technology, США, № 8335). Вторичные антитела – поликлональные козьи антитела против кроличьих иммуноглобулинов, меченные пероксидазой хрена (ПХ), или мышиных иммуноглобулинов, меченные щелочной фосфатазой (ЩФ) (Jackson Immunoresearch, США). В качестве субстрата использовали ImmunStar AP substrate (Bio-Rad, США) для ЩФ-конъюгированных антител и Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, США) для ПХ-

конъюгированных антител. Белки визуализировали на приборе FluorChem™ E System (ProteinSimple, США) и обрабатывали с помощью программы ImageJ. Уровень экспрессии нормализовали к экспрессии Gapdh или β-актина.

Количественная ПЦР (кПЦР). Клетки MEF Nf2-/-, MEF Nf2f/f, SC4-9 Babe и SC4-9 Мерлин выращивали в бессывороточных условиях. мРНК выделяли, используя набор RNeasy Minikit (Qiagen, США), согласно протоколу производителя. кПЦР с обратной транскриптазой выполнялась с использованием праймеров TaqMan для генов Fasn (ген синтазы жирных кислот (Fasn), Acaca (ген ацетил-коА карбоксилазы I Acc1), Асaсb (ген Acc2), Lpin1 (ген фактора транскрипции липина1, Lipin1), Acly (ген АТФ-цитратлиазы Acl), Acss2 (ген ацетил-коА синтетазы Acecs1), Acsl1 (ген лигазы длинноцепочечных жирных ацил-коА, long fatty acid acyl-coA ligase Acsl1), Srbp1 (ген стерольного регуляторного элемента 1, фактора транскрипции), Cpt1c (ген карнитилпальмитоилтрансферазы Iγ) и Cpt2 (ген карнитилпальмитоилтрансферазы II), на системе ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, США), нормализуя результаты к усреднённому уровню экспрессии генов «домашнего хозяйства» Actinb, Tbp1 и Hrpt.

42

Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-коА.

Стоковые водные 1 мМ растворы ацетил-, малонил- и пропионил-коА хранили при -80°C. При приготовлении стандартов для построения калибровочных кривых стоковые растворы растворяли в желаемой концентрации в смеси аммонийформата:ацетонитрила (30:70 по объёму).

Исследовали 4 группы образцов: клетки MEF Nf2-/- и MEF Nf2f/f в присутствии ДМСО (отрицательный контроль) или 5 µM церуленина. Для приготовления исследуемых образцов клетки выращивали на 30-см чашках Петри до достижения монослоя, после чего клетки собирали трипсинизацией с последующим центрифугированием, взвешивали и мгновенно замораживали жидким азотом. Каждый образец содержал 1 г клеточной массы. К размороженным образцам добавляли пропионил-коА в качестве внутреннего стандарта для оценки потерь при выделении ацил-коА, смесь гомогенизировали ультразвуком в 10% хлорной кислоте и нейтрализовали нейтрализующим буфером (2 M KOH, 0.4 M KCl и 0.4 M имидазол), центрифугировали 20 мин. на 8,000 g при +4°C и очищали твердофазной экстракцией (ТФЭ).

ТФЭ проводили на картриджах Waters Oasis HLB 3 (WAT094226, Waters,

США). Приготовленные как описано выше образцы закисляли 2% муравьиной кислотой, наносили на картридж и элюировали последовательно 0.2 мл воды, 0.2 мл метанола и 3 мл метанола. Последнюю порцию элюата (3мл метанола) лиофилизировали, сухой осадок растворяли в смеси аммонийформата:ацетонитрила (30:70 по объёму) и исследовали с помощью УВЭЖХМС/МС

Хроматографию проводили на хроматографе Waters Acquity H (UPLC, Waters, США). 10 μл очищенного образца или стандартов для калибровочных кривых или наносили на колонку Acquity HSS T3 (2.1 x 50 мм; размер частиц 1.8 μм) для изократического элюирования смесью аммоний-формата:ацетонитрила (30:70 по объёму). Элюирование проводилось при потоке 0.4 мл/мин. и 30°C, элюаты впрыскивались в ионизационную камеру масс-спектрометра Thermo (TSQ Quantum Access, США) для количественного анализа при следующих параметрах:

43

напряжение электрораспыления +4 kV; давление на распылителе 45 psi; давление вспомогательного газа 20 psi; давление ионообменного газа 2 psi; давление газа для соударений 1.5 мTorr; температура капилляра 380°C. Для обнаружения целевых ацил-коА в элюате использовался метод мониторинга множественных реакций. Массовые переходы для ацетил-коА, малонил-коА и пропионил-коА составляли соответственно 810303, 854347, и 824317 [116]. Площадь под индивидуальными пиками рассчитывалась с помощью встроенной программы

Xcalibur (версия 2.1, Thermo TSQ Quantum Access, США).

Резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET). Измерение активности Rac1 проводили с помощью FRET. Биосенсор, представляющий собой два плазмидных вектора: донорный pCyPet-Rac1, кодирующий белок Rac1, меченый голубым флуоресцентным белком (CFP), и акцепторный pYPet-PBD, кодирующий субстрат Rac1 р21-связывающий домен (PBD), меченый жёлтым флуоресцентным белком (YFP) были предоставлены лабораторией д-ра Клауса Хана. Протокол измерения активности Rac1 описан в [117]. Измерения проводили на конфокальном микроскопе Leica TCS SP8 с помощью встроенного программного обеспечения.

Исследования противоопухолевой активности соединений на ксенографтной модели НФ II. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с международными требованиями IACUC. Ксенографты с использованием клеток крысиной шванномы RT4 выполняли на самках бестимусных мышей (nu/nu), n=7, каждой мыши подкожно вводили 1 x 106 клеток RT4 в растворе PBS. Ксенографты с использованием клеток мышиной шванномы SC4-9 выполняли на самках бестимусных мышей (nu/nu), n=5. каждой мыши подкожно вводили 3 x 106 клеток SC4-9 в смеси матригель:PBS 1:1. Стоковый (100x) раствор церуленина, ловастатина или золедроновой кислоты в смеси ДМСО:этанол (1:4) хранили при -20oC. Рабочие растворы препаратов в кукурузном масле приготовляли перед процедурой ежедневно начиная с третьего

44

дня эксперимента и вводили животным с помощью желудочного зонда в дозе 2 мг/кг/день (церуленин), 1 мг/кг/день (ловастатин) и 0,4 мг/кг/день (золедроновая кислота). Объём опухолей измеряли в указанные дни по трём параметрам с помощью штангенциркуля и рассчитывали по формуле V = x*y*z/2

Среднюю ингибиторную концентрацию (IC50, концентрацию вещества,

при которой доля жизнеспособных клеток составляла 50%) рассчитывали по формуле IC50 = a+b*arctg(1-1/2c) после аппроксимации кривой Доза/Эффект логистической функцией y=с*(1-tg((x-a)/b)), где х – концентрация вещества, методом наименьших квадратов по коэффициентам а, b и с.

Статистический анализ. Все эксперименты по определению IC50 повторяли в трипликатах по 4 раза Эксперименты по выключению генов Fasn и Acaca и химическому модулированию активности Acc1 повторяли в трипликатах по 3 раза. Измерение FRET повторяли в трипликатах 4 раза. Определение уровня экспрессии ферментов липогенеза иммуноблоттингом и кПЦР повторяли 4 раза. Определение внутриклеточного уровня ацетил-коА и малонил-коА методом УВЭЖХ-МС повторяли 3 раза. Для построения таблиц использовали средние значения и доверительный интервал для вероятности P=95%. В экспериментах по определению уровня Casp3 и в исследованиях на ксенографтной модели статистическую значимость результатов p оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента с коррекцией по Уэлчу. В остальных исследованиях p оценивали по методу Холма-Сидака при α=5%.

45

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2

В работе использовали мышиные эмбриональные фибробласты (MEF), так как в норме в этих клетках наблюдается выраженная экспрессия гена Nf2, и имеются литературные данные, подтверждающие, что потеря данного гена оказывает значительный эффект на фенотип этих клеток [5, 33].

Первичные MEF, несущие флокс-аллель в гене Nf2, были любезно предоставлены доктором Марко Джованнини (dr Marco Giovannini, CEPH et

Institut Universitaire d’Hematologie, Paris, France).

Первичные культуры мышиных эмбриональных фибробластов (MEF Nf2flox/flox) были иммортализованы с помощью трансфекции большим Т-антигеном вируса SV40, как описано ранее [118]. Клетки, не подвергшиеся старению и миновавшие кризис (50 пассажей) сочли иммортализованными. Иммортализованные MEF Nf2flox/flox трансфецировали плазмидой pMSCV-Cre-GFP, несущей Cre-рекомбиназу и GFP (клетки MEF Nf2-/-). Контрольные клетки MEF

трансфецировали плазмидой pMSCV-GFP, несущей только GFP (MEF Nf2flox/flox). Через 48 часов после трансфекции клетки, несущие GFP, отбирали на проточном цитофлуориметре. Через две недели процедуру трансфекции и отбора GFP-позитивных клеток повторяли.

Для подтверждения нокаута гена Nf2 в клетках MEF Nf2-/- через 2 недели после вторичного отбора GFP-позитивных клеток было проведено генотипирование полученных линий и вестерн-блоттинг лизатов клеток.

Были синтезированы следующие праймеры:

1)P4 (5’-CTTCCCAGACAAGCAGGGTTC-3’)

2)P5 (5’-GAAGGCAGCTTCCTTAAGTC-3’)

3)P6 (5’-CCTCTATTTGAGTGCGTGCCATG-3’)

На рис. 9 представлена схема расположения сайтов посадки праймеров, использованных для генотипирования.

46

Рисунок 9 «Схема расположения сайтов посадки праймеров для типирования по гену Nf2»

При анализе электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле должны быть видны следующие полоски (см. табл. 2):

Таблица 2 «Распределение продуктов ПЦР (генотипирования) при электрофорезе в агарозном геле»

На рисунке 10 представлены результаты генотипирования клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox. Делеция гена Nf2 в клетках MEF Nf2-/- подтверждена распределением продуктов ПЦР в геле. Так, видно, что при использовании праймеров Р4 и Р5 образуются продукты нужного размера только с ДНК, выделенной из клеток MEF Nf2flox/flox, и с геномной ДНК мыши (442 и 305 п.о., соответственно) (рис 10). В то же время при ис пользовании праймеров Р5 и Р6 образуется визуализируемый продукт только в реакции с ДНК клеток MEF Nf2-/-

47

(338 п. о.) (рис. 10), где произошла делеция области гена Nf2, ограниченной floxсайтами.

Рисунок 10 «Гель-электрофорез продуктов ПЦР»

NF2-/- – ДНК, выделенная из иммортализованных MEF NF2flox/flox после трансфекции плазмидой, несущей Cre-рекомбиназу, и сортировки на проточном цитофлуориметре; NF2flox/flox

– ДНК клеток, трансфецированных контрольной плазмидой (pMSCV-GFP). В качестве положительного контроля на наличие гена Nf2 использовали геномную ДНК мыши (New England Biolabs, США), в качестве отрицательного контроля – стерильная дистиллированная вода.

Иммуноблоттинг лизатов клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox с антителами против мерлина (рис. 11) показал, что в клетках после трансфекции плазмидой, несущей Сre-рекомбиназу (MEF Nf2-/-), отсутствует продукция белка мерлин, в то же время в контрольных клетках MEF Nf2flox/flox продукция мерлина сохраняется на высоком уровне.

48

Рисунок 11 «Иммуноблоттинг лизатов клеток MEF Nf2-/- иMEF Nf2flox/flox»

Лизаты клеток получали, обрабатывая клетки буфером Роберта в течение 15 мин. при+40 С. Использовали моноклональные мышиные антитела к мерлину и к β-актину. В качестве вторичных антител использовали поликлональные козьи антитела против мышиных иммуноглобулинов, меченные щелочной фосфатазой

Полученные данные дают основание считать, что в клетках MEF Nf2-/- произошла делеция области гена Nf2, кодирующего белок мерлин и отсутствует синтез этого белка.

Влияние утраты белка мерлин на функциональные свойства клеток MEF Nf2-/-

Поскольку было показано, что мерлин участвует во взаимодействии компонентов цитоскелета и клеточной мембраны, при характеристике полученных клеток MEF Nf2-/- мы, в первую очередь, оценивали их морфологию и скорость прикрепления клеток к субстрату.

На рисунке 12 представлены фотографии клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox через 4 часа после пересева (световая микроскопия). Видно, что клетки MEF Nf2-/- выглядят более распластанными, с большим числом отростков. В чашках с MEF Nf2-/- наблюдается меньше нежизнеспособных всплывших клеток, чем в чашках с

MEF Nf2flox/flox.

49

Рисунок 12 «Световая микроскопия а) MEF Nf2-/- б) MEF Nf2flox/flox»

Клетки высевали на 10-см чашки Петри в концентрации 105 клеток на чашку и культивировали в течение 4-х часов в полной культуральной среде. Микроскопию проводили на инвертированном микроскопе при 20-кратном увеличении

При культивировании клеток было также выявлено, что клетки MEF Nf2-/- быстрее прикрепляются к субстрату и распластываются: так, прикрепившиеся и распластанные клетки MEF Nf2-/- обнаруживались в лунках уже через 15-20 минут после пересева, тогда как для клеток MEF Nf2 flox/flox это время составляло не менее 1 часа.

На рисунках 13 – 15 представлены результаты исследования функциональных свойств клеток MEF Nf2-/- (по сравнению с контрольными фибробластами MEF NF2flox/flox). Из анализа кривых роста видно (рис.13), что скорость роста существенно выше у клеток MEF Nf2-/-, и рост этих клеток не подвержен контактному торможению.

50

Рисунок 13 «Кривые роста клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox»

Клетки высевали на 10-см чашки в концентрации 105 клеток на чашку, ежедневно клетки трипсинизировали и производили подсчёт живых клеток с помощью камеры Горяева. Представлены средние значения по результатам 4-экспериментов (по 5 параллелей в каждом).

Во время наблюдения у клеток MEF Nf2flox/flox также не было обнаружено выраженного контактного торможения роста, однако их скорость роста начала замедляться после 6-ого дня исследования, а срок наблюдения был ограничен, поскольку при данных условиях роста на 9-10 день инкубирования клеток обеих линий не представлялось возможным получать гомогенные суспензии клетки для их подсчета.

Клетки MEF Nf2-/- также оказались более устойчивы к истощению среды (рис. 14). Так, при постоянном культивировании в бессывороточной среде значимая гибель клеток MEF Nf2flox/flox обнаруживалась уже на седьмой день, на восьмой день жизнеспособность сохраняли только 25% клеток, однако количество жизнеспособных клеток MEF Nf2-/- оставалось постоянным всё это время.

51

Рисунок 14 «Устойчивость клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox к истощению среды в бессывороточных условиях»

Представлена зависимость количества живых клеток от времени инкубации в 96луночном планшете без смены среды. Клетки, ресуспендированные в полной среде, высевали в планшеты в концентрации 10 тыс. клеток на лунку. Через 4 часа после посева среду меняли на бессывороточную и инкубировали клетки в течение 8 дней. Уровень выживаемости клеток оценивали с помощью модифицированного MTT-теста. Условное количество клеток рассчитывалось исходя из измерения оптической плотности при длине волны 485 нм. Для каждой клеточной линии количество клеток на момент посева (10 тыс. кл. на лунку) принято за

1.

Клетки MEF Nf2-/- также более устойчивы к действию одного из известных цитотоксических агентов – стауроспорина, который является мощным ингибитором киназ и вызывает гибель большинства типов клеток в концентрациях меньше, чем 0.1 мкмоль/л уже через 4 часа инкубации [119]. И хотя обе клеточные линии оказались достаточно устойчивы к действию стауроспорина (половинная ингибиторная концентрация (IC50) стауроспорина для клеток MEF Nf2flox/flox составила 1,035 ± 0,8 мкмоль/л, а для клеток MEF Nf2-/- 1,79

52

± 0,09 мкмоль/л), однако, в среднем, выживаемость клеток MEF Nf2-/- была выше, чем выживаемость клеток MEF Nf2 flox/flox (отличия в IC50 составили 57%) (см. рис. 15).

Рисунок 15 «Устойчивость клеток MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox к действию стауроспорина»

Представлена зависимость количества живых клеток от концентрации стауроспорина. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 10 тыс. клеток на лунку. Через 24 часа после посева добавляли стауроспорин. В качестве отрицательного контроля использовали ДМСО. После 12-часовой инкубации со стауроспорином оценивали уровень выживаемости клеток с помощью модифицированного MTT-теста. Условное количество клеток рассчитывали исходя из измерения оптической плотности при длине волны 485 нм. Для каждой клеточной линии среднее количество клеток в лунках с ДМСО принято за 1, остальные значения нормализованы к отрицательному контролю.

При получении стабильных клеточных линий необходимо было убедиться, что у нокаутной по гену Nf2 линии MEF Nf2-/- наблюдаются основные свойства, вызванные отсутствием мерлина, а контрольная линия MEF Nf2flox/flox не отличается от первичных клеток. К таким свойствам относят фенотипические и

53

ростовые характеристики клеток, а также, изменение уровня продукции и фосфорилирования некоторых белков в норме прямо или опосредованно взаимодействующих с мерлином.

Отличия в морфологии и скорости прикрепления клеток MEF Nf2-/- по сравнению с клетками MEF Nf2flox/flox (Рис. 12) отражают принципиальные изменения в организации актинового цитоскелета, это дает основание считать, что именно отсутствие мерлина обуславливает эти изменения актинового цитоскелета [29]. Ранее было показано, что наиболее существенным изменением, наступающим в результате утраты гена Nf2, является нарушение контактного торможения [5, 59]. Было установлено, что, действительно, рост клеток MEF Nf2-/- не подвержен контактному торможению. Клетки MEF Nf2flox/flox, обнаруживают неполное контактное торможение (рис. 13). Возможно, некоторое нарушение контактного торможения в клетках MEF Nf2flox/flox связано с тем, что при иммортализации в этих клетках был поврежден ген р53, поскольку ранее было показано взаимодействие между р53 и Nf2 [120]. У клеток MEF Nf2-/- была обнаружена устойчивость к истощению среды (рис. 14), что характерно для клеток, дефектных по гену Nf2-/- [121]. Выявленная повышенная устойчивость клеток MEF Nf2-/- к действию стауроспорина (рис. 15) ранее описана не была. Этот результат также подтверждает общую устойчивость клеток, лишенных мерлина, к действию апоптотических факторов.

На рисунке 16 представлен сравнительный анализ уровня продукции и фосфорилирования в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox некоторых белков, активность которых в норме напрямую или опосредованно регулируется мерлином. С помощью веcтерн-блоттинга в клетках MEF Nf2-/-, лишенных мерлина, выявлено повышение уровня фосфорилирования киназ Pak1/Pak2, что говорит об их активации; выявлено повышение уровня продукции белков,

участвующих в регуляции апоптоза, - Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) и Bcl-XL (B-cell leukemia/lymphoma XL); повышение уровня фосфорилирования по серину

136 белка Bad (Bcl2-associated agonist of cell death), являющегося участником антиапоптотического пути Akt – Bad; а также снижение уровня

54

фосфорилирования по серину 338 белка Raf1 (v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog 1), принадлежащего к семейству MAP3K-киназ.

Рисунок 16 «Уровни продукции и фосфорилирования некоторых белков в клетках MEF Nf2-/- и MEF Nf2 flox/flox»

Лизаты клеток получали, обрабатывая клетки буфером Роберта в течение 15 мин. при+40С. Использовали поликлональные первичные антитела: анти-Bcl-2, анти-BclXL, антиphosphoPak1(Ser144)/phosphoPak2 (Ser141), анти-phosphoBad (Ser136), анти-Bad и

моноклональные первичные антитела: анти-phospho Raf1 (Ser338), анти-Merlin и анти-β-Actin. В качестве вторичных антител использовали поликлональные козьи антитела против кроличьих или мышиных иммуноглобулинов, меченные, соответственно, пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. В качестве субстрата использовали Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate или Bio-Rad ImmunStar AP Substrate.

55

Анализ уровня продукции и фосфорилирования белков, прямо или косвенно связанных с белком мерлин, показал, что в клетках MEF Nf2-/- происходит выраженная активация киназ Pak1 и Pak2 (рис. 16), что соответствует ожидаемой картине, поскольку известно, что мерлин ингибирует р21-зависимые киназы [37, 42]. Активация Pak1 приводит к запуску пролиферативного каскада Mek (Mapk/Erk kinase, киназа митоген-активируемых киназ) – Erk (extracellularregulated protein kinase, митоген-активируемая киназа) [122] (см. рис. 17). Таким образом, активация Pak1 в клетках, дефектных по гену Nf2, может быть одной из причин, обусловливающих разницу в скорости роста между клетками линий MEF

NF2-/- и MEF NF2flox/flox.

Ранее было показано, что мерлин ингибирует комплекс Mtorс2, что приводит к запуску антиапоптотического пути Akt – Bad [123] (см. рис. 17).

Рисунок 17. «Возможная роль белка мерлин в апоптозе и пролиферации, опосредованных взаимодействием комплекса mTor, киназ Akt и белка Bad» (см.

описание в тексте)

56

Комплекс Mtorc2 активирует киназу Akt, которая в норме ингибирует белок Bad, фосфорилируя его по серину 136. Bad в нефосфорилированном состоянии является проапоптотическим белком, подавляя экспрессию генов Bcl-2 и Bcl-XL и удерживая комплекс антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-XL. Фосфорилирование Bad, напротив, приводит к повышению экспрессии генов Bcl- 2 и Bcl-XL и к диссоциации комплекса белков Bcl-2 и Bcl-XL. Таким образом, Bad, фосфорилированный по серину 136, является мощным антиапоптотическим агентом [123]. Повышение уровня фосфорилированной Pak1 также вносит вклад в активацию Akt – Bad, поскольку было показано взаимодействие Pak1 и Akt [122].

Было установлено, что общий уровень продукции проапоптотического белка Bad одинаков в обеих клеточных линиях, однако уровень активированного Bad, фосфорилированного по серину 136 (т. е., антиапоптотической формы Bad) несколько выше в MEF Nf2-/-, что косвенно свидетельствует об активации комплекса Mtorc2 и сигнального пути Akt – Bad. По-видимому, активацией Bad объясняется и лучшая выживаемость этих клеток по сравнению с контрольной клеточной линией. Также, об активации пути Mtorc2 – Akt – Bad косвенно свидетельствует и пониженный уровень фосфорилированного по серину 338 белка Raf1 [122, 124]. Результатом активации Bad в MEF Nf2-/- является повышенная экспрессия антиапоптотических генов Bcl-2 и Bcl-XL, что, очевидно, также вносит вклад в выживаемость этих клеток. Таким образом, в клетках MEF Nf2-/-, лишенных белка мерлин, удалось подтвердить активацию сигнальных путей, в норме подавляемых мерлином, (Pak1, Pak2, Mtor-Akt).

В данной работе получены две линии клеток, отличающихся только по одному гену Nf2, что может стать мощным инструментом для изучения взаимодействий мерлина, а также для поиска лекарственной терапии НФ II. Ранее делались попытки сравнивать клетки Nf2-дефектных опухолей с клетками нормальной ткани [5], а также описать эффекты, вызываемые нокаутом гена Nf2, на первичных клетках [125]. Однако, оба пути, очевидно, не подходят для создания клеточной модели НФ II, т. к. в первом случае различия между клетками могут быть обусловлены не только отсутствием мерлина, но и повреждением

57

других генов, а во втором случае невозможны эксперименты, требующие длительного культивирования клеток. Независимо от наших исследований сходная клеточная модель на основе спонтанно иммортализованных MEF Nf flox/flox была получена в лаборатории N. Ratner [60], однако есть данные, что иммортализация большим Т-антигеном вируса SV40 имеет преимущества перед остальными способами иммортализации, поскольку клетки сохраняют фенотип, близкий к исходным первичным клеткам [126]. Полученные в работе линейные клетки были использованы для выполнения скрининга биологически-активных соединений с целью поиска терапии НФ II.

Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ

Скрининг был проведён на клетках линий MEF Nf2-/- и MEF Nf2flox/flox, чтобы оценить избирательную токсичность соединений в отношении Nf2-отрицательных клеток. На рис. 18 представлены первичные результаты скрининга, и цветом выделены вещества, удовлетворяющие критериям отбора (соотношение жизнеспособных клеток MEF Nf2-/- к MEF Nf2flox/flox < 0,8; FDR по методу Бенджамини-Хохберга < 20%). Девять веществ, удовлетворяющих критериям отбора, представлены в таблице на табл. 3.

58

Рисунок 18. «Первичные результаты скрининга коллекции низкомолекулярных биоактивных соединений»

Скрининг коллекции ICCB Known Bioactives (Biomol, США) был выполнен на двух клеточных линиях: экспериментальной MEF NF2-/- и контрольной MEF NF2flox/flox, в

трипликатах, и повторён дважды. Перенос веществ осуществлялся с помощью прибора CyBi Well Vario (CyBio, США), объём переноса – 100 нл. Перенос осуществляли через 4 часа после посева клеток. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель (ДМСО). В качестве положительного контроля использовали стауроспорин в конечной концентрации 20 мкмоль/л. После 48-часовой инкубации с биоактивными веществами оценивали уровень выживаемости клеток с помощью модифицированного MTT-теста. Веществами, показавшими

положительный результат, считали такие, для которых соотношение жизнеспособных клеток MEF NF2-/- к MEF NF2flox/flox было < 0,8, a ожидаемая доля ложных отклонений гипотез (FDR)

по методу Бенджамини-Хохберга < 20%

Таблица 3. «Вещества, удовлетворяющие критериям отбора»

59

Первичная валидация результатов скрининга

Построение кривых Концентрация/Эффект и тестирование соединенийкандидатов на Nf2-отрицательных линиях

Для кандидатов, идентифицированных с помощью скрининга, определены IC50 для обеих клеточных линий. Из девяти веществ, выбранных изначально, только четыре:

ловастатин (Enzo Life Sciences, США, № BML-G226-0010)

– ингибитор 3-гидрокси-метилглутарил-коА редуктазы; церуленин (Enzo Life Sciences, США, № BML-G237-0005)

– ингибитор синтазы жирных кислот;

ресвератрол (Enzo Life Sciences, США, № BML-FR104-0100)

– антагонист ваниллоидных рецепторов

показали постоянные значимые различия токсичности в отношении Nf2- отрицательных и Nf2-положительных клеток (рис. 19)

60

Рисунок 19. «Сравнение действия исследуемых соединений на Nf2отрицательные и контрольные клетки»

61

Эксперименты повторяли в трипликатах по 4 раза. Клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 104 клеток/лунку. Через 4 часа после высева клеток в планшеты добавляли биоактивные вещества и инкубировали 48 часов. Уровень пролиферации и выживаемости клеток оценивали с помощью модифицированного МТТ-теста. IC50 определяли по следующему алгоритму: методом наименьших квадратов по коэффициентам а, b и с кривую Концентрация/Эффект аппроксимировали логистической функцией y=с*(1-tg((x-a)/b)), где х – концентрация вещества. IC50 рассчитывали по формуле IC50=a+b*arctg(1-1/2c). Для построения таблиц использовали средние значения IC50 и доверительный интервал для вероятности P=95%. Статистическую значимость результатов p оценивали с помощью двухвыборочного t-критерия Стьюдента.

62

Таблица 4 «Сравнение действия исследуемых соединений на Nf2отрицательные и контрольные клетки.»

n = 4, P = 95%

Эти вещества были протестированы на клетках других Nf2-отрицательных линий (SC4-9 и RT4) (рис. 20). У ловастатина, церуленина и ресвератрола IC50 для клеток линий SC4-9 и RT4 были сравнимы с IC50 для клеток линии MEF Nf2-/- (табл. 5). К капсаицину клетки линий SC4-9 и RT4 оказались нечувствительны.

Рисунок 20. «Тестирование исследуемых соединений на различных Nf2отрицательных клеточных линиях»

63

RT4 – клетки линии крысиной Nf2-отрицательной шванномы, SC4-9 – клетки линии мышиной Nf2-отрицательной шванномы.

64

Таблица 5 «Тестирование исследуемых соединений на различных Nf2отрицательных клеточных линиях»

n = 4, P = 95%

Тестирование фармакологических аналогов соединений, отобранных по результатам скрининга

Из трёх соединений, одинаково проявивших себя в отношении клеток всех трёх Nf2-отрицательных линий, ловастатин является ингибитором 3-гидрокси-3- метилглутарил-КоА-редуктазы (ГМГ-коА редуктазы), церуленин – ингибитором синтазы жирных кислот, ресвератрол – природным полифенолом, активатором протеиндеацетилазы SIRT1. Поэтому на следующем этапе работы были протестированы различные модуляторы активности данных ферментов, чтобы убедиться, что селективная токсичность ловастатина, церуленина и ресвератрола связана с их прямым действием, а не с неизученными побочными эффектами этих соединений. В работе использовали синтетические ингибиторы 3-гидрокси-

Life Sciences, США, № ALX-270-466-M010), симвастатин

65

(Enzo Life Sciences, США, № BML-G244-0050) и мевастатин

(Enzo Life Sciences, США, № BML-G233-0010);

ингибиторы синтазы жирных кислот: С75

(Enzo Life Sciences, США, № ALX-270-286-M001)– синтетический аналог

(Enzo Life Sciences, США, № BML-GR359-0005) и

66

кверцетин (Enzo Life Sciences, США, № ALX-385-001- G005). Все соединения проявили селективную токсичность в отношении Nf2- отрицательных клеток (рис. 21), что доказывает, что ГМГ-коА редуктаза, синтаза жирных кислот и проеиндеацетилаза SIRT1 имеют большое значение для выживания Nf2-отрицательных клеток.

Рисунок 21. «Тестирование фармакологических аналогов ловастатина, церуленина и ресвератрола»

67

Эксперименты повторяли 4 раза в трипликатах, на графиках отображены средние значения и доверительный интервал для вероятности 95%

68

Таблица 6 «Тестирование фармакологических аналогов ловастатина, церуленина и ресвератрола»

n = 4, P = 95%

Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии Nf2-отрицательной шванномы

Чтобы подтвердить, что селективная токсичность выбранных веществ обусловлена отсутствием белка мерлин в клетках Nf2-отрицательных линий, в клетках линии SC4-9 реэкспрессировали белок мерлин (рис. 22). Для оценки эффективности трансфекции клетки SC4-9 были трансфецированы плазмидным вектором, несущим ген зелёного флуоресцентного белка (GFP), позволяющего идентифицировать успешно трансфецированные клетки по флуоресценции. Эффективность трансфекции составила ≈ 30-40% (рис. 22). Для восстановления экспрессии белка мерлин в клетках SC4-9 эти клетки трансфецировали плазмидным вектором pBabe-NF2-puro, несущим ген Nf2. Поскольку размеры обоих векторов примерно одинаковы, можно ожидать одинаковой эффективности трансфекции. Уровень экспрессии белка мерлин оценивали с помощью иммуноблоттинга (рис. 22)

69

Рисунок 22 «Оценка эффективности трансфекции и уровня экспрессии белка мерлин.»

Эффективность трансфекции клеток линии SC4-9 плазмидным вектором pEGFP оценивалась визуально по соотношению флуоресцирующих клеток к общему количеству клеток на инвертированном флуоресцентном микроскопе. Экспрессия белка мерлин подтверждена иммуноблоттингом с помощью моноклональных антител против белка мерлин. В качестве контроля загрузки геля использовали моноклональные антетела против Gapdh.

Реэкспрессия белка мерлин в клетках шванномы привела к подавлению эффекта ловастатина и церуленина (рис. 23). Для ресвератрола IC50 (SC4-9 GFP) и IC50 (SC4-9 мерлин) не отличались.

70

Рисунок 23 «Сравнение IC50 ловастатина и церуленина в отсутствие и при наличии белка мерлин.»

SC4-9 Babe – клетки линии мышиной Nf2-отрицательной шванномы, трансфецированные контрольным плазмидным вектором pBabe-puro. SC4-9 Мерлин - клетки линии мышиной Nf2-отрицательной шванномы, трансфецированные плазмидным вектором pBabe-Merlin, кодирующим белок мерлин.

71

Таблица 7 «Сравнение IC50 ловастатина и церуленина в отсутствие и при наличии белка мерлин.»

n = 4, P = 95%

Таким образом, из девяти соединений, удовлетворявших критериям отбора скрининга, для дальнейших исследований были выбраны два – ловастатин и церуленин.

Фармакотерапия для НФ II до сих пор не разработана. В настоящее время в случае возникновения неоперабельных эпендимом применяется пульс-терапия комбинацией ломустина, винкристина и преднизолона или, альтернативно, карбаплатина и винкристина, с последующей лучевой терапией [127].

Недавно была осуществлена успешная попытка использования эрлотиниба у пациентов с неоперабельными шванномами слуховых нервов. Лечение привело не только к уменьшению размера опухолей, но и к частичному восстановлению слуха у пациентов [6]. Положительные результаты также принесло применение в подобных случаях бевацизумаба – препарата моноклональных антител к эндотелиальному фактору роста [7]. Оба препарата в настоящее время находятся во второй фазе клинических испытаний (идентификаторы протоколов в списке протоколов клинических испытаний Национального института здоровья США, соответственно, NCT00503841 и NCT01767792). Таким образом, до сих пор стратегия поиска фармакопрепаратов для лечения НФ II заключалась в применении уже известных антинеопластических препаратов у пациентов с неоперабельными опухолями. Насколько нам известно, никто не проводил скрининг широкого спектра биоактивных веществ с целью поиска соединений, действующих на Nf2-отрицательные клетки. Следует подчеркнуть, что обнаруженные нами соединения-кандидаты - ловастатин и церуленин - не относятся к классу противоопухолевых препаратов. Ловастатин, ингибитор 3- гидрокси-метилглутарил-коА редуктазы, является гиполипидемическим