новая папка 2 / 123525

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Самарская государственная сельскохозяйственная академия»

Л. Ф. Заспа, А. М. Ухтверов

Биотехнология в животноводстве

Методические указания для практических занятий

Кинель РИО СГСХА

2019

УДК 631.147

З36

Заспа, Л. Ф.

З36 Биотехнология в животноводстве : методические указания / Л. Ф. Заспа, А. М. Ухтверов. – Кинель : РИО СГСХА, 2019. – 27 с.

Методические указания для практических занятий «Биотехнология в животноводстве» составлены в соответствие с рабочей программой дисциплины и предназначены для студентов направления подготовки

36.04.02 Зоотехния.

Учебное издание содержит материал по основным вопросам биотехнологии в области животноводства, рассмотрены биотехнологические методы, приемы и средства для более рационального использования и повышения продуктивности сельскохозяйственных животных.

Методические указания способствуют формированию у магистров знаний о роли, значении и месте биотехнологии в сельском хозяйстве, а также применении и усовершенствовании биотехнологичеких методов в животноводстве.

©ФГБОУ ВО Самарская ГСХА, 2019

©Заспа Л.Ф., 2019

2

Предисловие

Новейшие технологии генетической инженерии позволяют существенно усовершенствовать традиционные биотехнологические процессы, а также получать принципиально новыми, ранее недоступными способами разнообразные ценные продукты.

Цель издания – научить будущих магистров практической деятельности, требующей углубленную фундаментальную и профессиональную подготовку, к научно-исследовательской работе в области применения биотехнологии для совершенствования и создания высокопродуктивных стад, пород, типов сельскохозяйственных животных.

Выполнение практических работ по дисциплине «Биотехнология в животноводстве» направлено на формирование соответствующих данному курсу знаний и компетенций (в соответствии с ФГОС ВО и требованиями к результатам освоения ОПОП).

Магистр должен профессионально решать вопросы внедрения биотехнологии в сельское хозяйство, управлять производством высококачественной продукции, проводить научные исследования с использованием сложных экспериментов и наблюдений.

3

ЗАНЯТИЕ 1-2. ФЕРМЕНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Цели занятия. Изучить роль основных ферментов и их использование в генетической инженерии; рассмотреть механизм действия ферментов генетической инженерии.

Ферменты генетической инженерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности и т.д.

Основными ферментами генетической инженерии являются: ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы, нуклеазы, рестриктазы.

Ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера – подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

ДНК-полимеразы. Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E. Сoli. ДНКполимераза I E.Сoli (не связывается с молекулами двухцепочечной кольцевой ДНК. Однако, если такие молекулы денатурировать и получить одноцепочечные формы, то с последними полимераза связывается в количествах, пропорциональных длине этих участков – примерно одна молекула на 300 нуклеотидных остатков.

Одним из наиболее часто используемых ферментов в генетической инженерии является ДНК – полимераза I, выделяют которую из E.Coli или фага Т-4.

ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять нить ДНК в направлении 5/ – 3/ путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство используется для построения второй комплементарной цепи. При добавлении фермента к одноцепочной ДНК-матрице в присутствии праймера (затравки) произойдет ее удвоение, это свойство используется для создания, например, ДНК-библиотек. ДНК-полимераза необходима также для заполнения «бреши» в цепи ДНК, для застраивания ее с выступающими

4

5/-концами. Экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.

Имеются специфические термостабильные ДНК-полимеразы, выделенные из бактерий Thermus aquaticus, живущих в гейзерах, использование которых позволяет проводить амплификацию – множественную наработку любого фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Таq-полимераза, не только упростил некоторые старые методики генетической инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов.

Из некоторых вирусов была выделена специфическая ДНКполимераза – РНК-зависимая ДНК-полимераза, названная обратной транскриптазой, или ревертазой. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК на РНК-матрице. С помощью ревертаз можно получать кДНК – ДНК-копии мРНК. кДНК позволяют изучать строение генов и идентифицировать полноценные копии этих генов в геноме.

ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами.

В1961 г. Мезельсон и Вейгл показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК.

В1967 году был открыт фермент, участвующий в сшивании фрагментов ДНК и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

Вгенной инженерии наиболее часто используют ДНК-лигазу фага Т-4, с помощью которой соединяют любые фрагменты ДНК

слюбыми концами: «липкими», «тупыми».

Нуклеазы – большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот, которые в результате распадаются на фрагменты или отдельные нуклеотиды.

Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (мРНК после трансляции, а также защита клетки от чужих нуклеиновых кислот

5

(при заражении бактерии фагом происходит расщепление фаговой ДНК нуклеазами бактерий).

По типу нуклеазы делятся на экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5/ или с 3/ свободных концов.

Эндонуклеазы могут расщеплять кольцевые ДНК или внутри последовательности фрагмента.

Выделяют нуклеазы, которые действуют:

–только на ДНК (ДНКазы);

–только на РНК (РНКазы);

–либо на ДНК и РНК одновременно;

–избирательно могут действовать на одноцепочечную (нуклеаза S1), двухцепочечную (эндонуклеаза III) молекулы ДНК;

–гибридную ДНК – РНК молекулу (рибонуклеаза Н). Рестриктазы. Общепринято термины «рестриктаза», «эндо-

нуклеаза рестрикции» считать синонимами.

Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) – это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции). Еще в 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E.Сoli, введенная в клетки другого штамма не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты.

Отдельную группу в генной инженерии представляют специфические эндонуклеазы – рестриктазы. Рестриктазы представляют собой эндонуклеазы бактериального происхождения, предназначенные для защиты клеток бактерий от чужеродной (вирусной) ДНК.

Впервые рестриктазы были выявлены в клетках кишечной палочки (E.Coli), зараженных бактериофагом λ (лямбда).

При этом выявлено, что «фаговое потомство», выращенное на двух различных штаммах этой бактерии, размножается по-разному в клетках противоположных штаммов.

Наличие в клетке двух ферментов (рестриктазы и ДНКметилазы) создает систему R-М, которая обеспечивает комплексную защиту ее ДНК. Система R-М препятствует скрещиванию между штаммами разных видов бактерий и тем самым обеспечивает сохранность их видов в эволюции.

6

Вгенетической инженерии рестриктазы используются для фрагментации молекул ДНК при создании рекомбинантных геномов.

Важные особенности рестриктаз:

– способность фермента узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности ДНК;

– существует большое количество различных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых узнает специфическую последовательность.

Определенные специфические последовательности, по которым рестриктазы гидролизуют ДНК, называются сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта, либо вблизи от него.

Выделяют 3 типа рестриктаз: рестриктазы первого типа разрывают цепи ДНК случайным образом, от сайта рестрикции, который они узнают. Расстояние от сайта рестрикции, на котором происходит разрезание, может быть от нескольких десятков до несколько тысяч пар нуклеотидов (п.н.).

Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач.

Рестриктазы III типа похожи на рестриктазы I типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20 - 35 п.н. от сайтов узнавания и также довольно редко используются в практических целях.

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул, – рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180 градусов последовательностями – палиндромами.

Внастоящее время выделено более 500 рестриктаз II типа, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же

7

последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами.

Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:

1.Мелкощепящие – сайт рестрикции 4 п.н.;

2.Среднещепящие – сайт рестрикции 6-8 п.н.;

3.Крупнощепящие – сайт рестрикции 10-14 п.н.

По тому, как они расщепляют ДНК их относят к двум группам:

1.группа вносит разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, образуются «тупые» концы;

2.группа вносит разрывы со сдвигом, с образованием «ступенек» – «липкие» концы.

Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигаза, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами более удобны для создания рекомбинантных ДНК, т.к. ДНКлигаза обеспечивает беспрепятственное соединение фрагментов.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах активности. Это такое количество фермента, которое необхо-

димо для полного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных условиях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются индивидуальными и зависят от рН, ионной силы, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции. Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии.

Задания

1.Запишите термин «ферменты», укажите какую роль выполняют ферменты.

2.Заполните таблицу 1.

Таблица 1

Ферменты в генетической инженерии

3. Перечислите типы рестриктаз, укажите важные их особенности.

8

Контрольные вопросы

1.Перечислите основные ферменты генетической инженерии.

2.Какую роль выполняют ферменты в генетической инженерии?

3.Каковы основные особенности рестриктаз, сколько их типов?

4.Какие основные функции полимеразы вы знаете?

5.Что понимают под рекомбинантной ДНК?

6.Что называют сайтами рестрикции?

7.Каковы основные функции нуклеаз?

ЗАНЯТИЕ 3-6. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Цели занятия. Изучить основные методы получения трансгенных животных; рассмотреть преимущества и недостатки генноинженерных методов.

Методы получения трансгенных животных. Современные методы селекции сельскохозяйственных животных базируются на использовании внутривидовой генетической изменчивости. Как правило, виды генетически изолированы друг от друга и не скрещиваются между собой, так как этому препятствует репродуктивная изоляция. В классической селекции, где используют для скрещивания животных с половой совместимостью, нельзя применять межвидовую генетическую изменчивость и создавать новые генетические формы, так как рекомбинация генов происходит только между хромосомами животного одного вида. Преодолеть биологические границы видов и использовать межвидовую генетическую изменчивость для создания новых форм животных можно с помощью переноса генов. Под переносом чужеродного гена понимают пересадку in vitro рекомбинацией конструкции гена в клетки другого животного вне зависимости от его видовой принадлежности. Если рекомбинантная конструкция гена интегрировалась в геном другого животного, то такой ген обозначается как трансген. Кодируемый трансгеном белок носит название трансгенного продукта. Животное, которое содержит в своем геноме трансген, называется трансгенным. Если животные передают трансгены своим потомкам, то образуются родственные группы трансгенных животных – трансгенные линии.

Трансгенными называют животных с измененной наследственностью, которая вызвана включением в их геном чужеродных генов с помощью следующих генноинженерных методов:

9

Микроинъекции гена. Предварительно у животных гормональной обработкой вызывают суперовуляцию и проводят оплодотворение. Затем извлекают эмбрионы на стадии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров. Для микроинъекции эмбрионов необходим рабочий стол, на который устанавливают микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Для инъекции эмбрионы по мере надобности посредством пониженного давления фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. После инъекции эмбрионы освобождаются от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам. Так, в оплодотворенных яйцеклетках мыши пронуклеусы хорошо видны, их легко инъецировать. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидсодержащие гранулы, они затрудняют визуализацию пронуклеусов. Поэтому предварительно проводят центрифугирование. При этом гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки и пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. Затем эмбрионы культивирования in vitro (до нескольких часов) и хирургически трансплантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов.

Для образования трансгенных линий животных значение имеет получение таких трансгенных животных, у которых часть половых клеток содержат трансген. Возможно появление мозаик – животных, состоящих из двух или нескольких клеточных линий, происходящих от одной зиготы, но имеющих различные генотипы. Часть мозаиков не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству. Чтобы получить одно трансгенное животное, трансген которого был бы включен в геном животного, и оно было способно дать трансгенное потомство, необходимо не менее 100 беременностей после пересадки микроинъецированных эмбрионов. Эффективность микроинъекций у крупных домашних животных низкая.

10