Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

Рис. 18.18. Конструкции со «смысловой» и «антисмысловой" ориентациями гена полифенолоксидазы. Транскрипция в обоих случаях осуществлялась под контролем одного из промоторов: 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (p35S), промотора гена синтазы гранулосвязанного крахмала (рС BSS) или промотора гена пататина 1 (pPATATIN), а также сигнала терминации транскрипиии гена нопалинсинтазы (tNOS). Л и Π — левая и правая фланкирующие последовательности Т-ДНК соответственно. (По данным работы Bachern et al.,

Bio/Technology 12: 1101-1105, 1994.)

трансформированные этими конструкциями, были высокоустойчивы к черной пятнистости (ферментативное изменение цвета), причем уровень устойчивости был гораздо выше, чем тот, которого удавалось достичь при обычном скрещивании. Трансгенные растения, несущие кДНК полифенолоксидазы, преднамеренно повреждали, а затем оценивали их устойчивость к черной пятнистости. Большинство трансгенных растений, в геноме которых присутствовал ан-тисмысловой вариант гена полифенолоксидазы, находящегося под контролем либо 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты, либо промотора гена синтазы гранулосвязанного крахмала, были значительно более устойчивы, чем нетрансформированные. Активность промотора гена пататина в клубнях картофеля, повидимому, проявлялась лишь частично, и накопление полифенолоксидазы не блокировалось. Все растения, содержащие смысловые конструкции, синтезировали полифенолоксидазу в большем количестве и были подвержены поражениям в большей степени, чем контрольные. Хотя все эти результаты носят сугубо предварительный характер, описанный подход может оказаться полезным для борьбы с ферментативным изменением цвета плодов различных коммерчески ценных растений.

Изменение вкуса

Невкусные фрукты и овощи вряд ли будут пользоваться покупательским спросом, даже если они имеют высокую пищевую ценность. Конечно, вкус пищевых продуктов можно улучшить в процессе приготовления добавлением соли, сахара, ароматизаторов или других добавок, однако с экономической точки зрения было бы лучше, если бы пищевые продукты исходно обладали необходимыми вкусовыми качествами и выглядели более аппетитно.

В плоде африканского растения Dioscorephyllum cumminsii Diels содержится белок монеллин, примерно в 100 000 раз более сладкий, чем сахароза в эквимолярных количествах. Этот белок вполне может служить заменителем сахара, обладающим еще и тем преимуществом, что, не являясь углеводом, он не должен оказывать вредного воздействия на метаболизм.

Монеллин — это двухцепочечный димер; А-цепь состоит из 45 аминокислотных остатков, B-цепь — из 50. Цепи связаны между собой слабыми нековалентными связями, и это ограничивает его применение в качестве подсластителя, поскольку при нагревании в процессе приготовления пищи или под действием кислот (например, лимонной или уксусной) он легко диссоциирует и теряет свои вкусовые качества, Задача создания трансгенных растений или микроорганизмов, способных синтезировать монеллин, усложняется тем, что необходимо клонировать и координированно экспрессировать два отдельных гена. Чтобы решить эту проблему, был химически синтезирован ген монеллина, кодирующий А- и B-цепи как один полипептид. Были созданы трансгенные растения томата и салата, синтезирующие химерный белок. Для этого использовали два разных промотора. В случае томатов это был Е8-промотор, специфичный для плодов и активизирующийся в самом начале их созревания. В растениях салата ген находился под контролем 35Sпромотора вируса мозаики цветной капусты. В обоих случаях использовались сайты терминации

транскрипции/полиаденилирования гена нопалинсинтазы в составе Ti-плазмиды. Синтетический ген монеллина вводили в растительные клетки инфицированием их A. tumefaciens, используя коинтегративную векторную систему на основе Ti-плазмид. Монеллин был обнаружен в зрелых и частично зрелых плодах и в листьях салата, но не в зеленых помидорах, при этом его содержание в томатах повышалось при резком повышении концентрации растительного гормона этилена. Сообщения о всесторонних испытаниях вкусовых качеств генетически подслащенных пищевых продуктов пока отсутствуют, но если результаты окажутся положительными, то описанный способ подслащения плодов можно будет использовать для многих культур.

Растения как биореакторы

Растения дают большое количество биомассы, а выращивание их не составляет труда, поэтому разумно было попытаться создать трансгенные растения, способные синтезировать коммерчески ценные белки и химикаты. В отличие от ре-комбинантных бактерий, которых культивируют вбольш их биореакторах (при этом необходимы высококвалифицированный персонал и дорогостоящее оборудование), для выращивания сельскохозяйственных культур не нужно больших средств и квалифицированных рабочих. Основная проблема, которая может возникнуть при использовании растений в качестве биореакторов, будет связана с выделением продукта введенного гена из массы растительной ткани и сравнительной стоимостью производства нужного белка с помощью трансгенных растений и микроорганизмов. Уже созданы экспериментальные установки по получению с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов антител и полимера поли- р-гидроксибутирата, из которого можно изготавливать материал, подверженный биодеградации,

Антитела

Производство антител и их фрагментов с помощью трансгенных растений имеет ряд преимуществ перед их синтезом в клетках рекомбинантных микроорганизмов. Трансформация растений носит стабильный характер, чужеродная ДНК практически необратимо встраивается в растительный геном, в то время как большинство микроорганизмов трансформируются плазмидами. которые могут утрачиваться в ходе длительной или крупномасштабной ферментации. Кроме того, процессинг и укладка чужеродных белков в растениях аналогичны таковым в животных клетках, в то время как в бактериях процессинг, укладка и посттрансляционные модификации эукариотических белков затруднены. Кроме того, крупномасштабное выращивание растений не требует больших затрат и не лимитируется возможностями процессов ферментации. И наконец, можно создать условия, при которых чужеродные белки будут синтезироваться в семенах, где их целостность не нарушится длительное время.

Полимеры

Крупномасштабный бактериальный синтез поли-β-гидроксибутирата, полимера, из которого получают пластик, подверженный биодеградации, обходится довольно дорого. Поэтому интересно было выяснить, можно ли получать этот полимер с помощью трансгенных растений, В бактериях типа Alcaligenes eutrophus поли-β-гидроксибутират синтезируется из ацетил-СоА в три стадии, катализируемые тремя ферментами (см. рис. 12.22), гены которых входят в один оперон. Растения неспособны процессировать транскрипт оперо-на с более чем одним геном, поэтому каждый из генов был клонирован по отдельности и встроен в хлоропластную ДНК растения Arabidopsis thaliana. Хлоропласты были выбраны потому, что, как показали выполненные ранее эксперименты, в цитоплазме полимер синтезировался в небольшом количестве, при этом большинство растений были чахлыми. Кроме того, в хлоропластах может накапливаться другой биополимер — крахмал.

К каждому из трех генов поли- β -гидроксибутирата были присоединены фрагменты ДНК, кодирующие хлоропластную сигнальную последовательность малой субъединицы рибулозобисфосфат-карбоксилазы гороха, и каждый ген был помещен под транскрипционный контроль 35S-промотора вируса мозаики цветной капус-

ты. Гены были введены в растения A. thaliana в составе бинарных векторов на основе Tiплазмид. Два трансгенных растения, каждое со своим чужеродным геном, скрещивали, чтобы получить растения с двумя чужеродными генами, включенными в хлоропластную ДНК. Затем трансгенное растение с двумя чужеродными генами скрещивали с растением, несущим третий чужеродный ген, и отбирали растения, несущие все три бактериальных гена поли-β-гидроксибутирата. В зрелых листьях некоторых трансгенных растений, экспрессирующих все три бактериальных гена, синтезировалось более 1 мг поли-β- гидроксибутирата на I г сырой ткани листа. Эту работу можно считать первым важным шагом в создании сельскохозяйственных культур, которые можно использовать для получения в больших количествах поли-β-гидроксибутирата

Чужеродные белки, аккумулирующиеся в семенах

Олеозины, или белки масляных телец, содержатся в семенах различных растений. Они весьма гидрофобны и стабилизируют масляные тельца как дискретные структуры. При этом их N- и С-концевые участки более гидрофильны, чем внутренняя область молекулы, и экспонированы в водное окружение. Используя генную инженерию, можно попытаться создать реком-

Рис. 18.19. Рекомбинантный белок, компонентами которого являются олеозин и водорастворимый белок. Олеозин обладает высоким сродством к масляному тельцу семени растения, а его N- и С-концы, а также второй белок гидрофильны и экспонированы в водное окружение.

бинантные белки из олеозинов и водорастворимых белков (рис. 18.19): рекомбинантные белки будут аккумулироваться в масляных тельцах, что позволит относительно легко их очистить. При этом водорастворимый белок будет экспонирован в водное окружение, и при необходимости его можно будет отщепить. Это позволяет значительно удешевить процедуру очистки белков, синтезируемых растениями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вводя в геном растений чужеродные гены и обеспечивая их экспрессию, можно относительно быстро создавать новые сорта растений. Уже получены трансгенные растения, устойчивые к неблагоприятным условиям окружающей среды, к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам, окислительному и солевому стрессам. Выведены культуры с необычной окраской цветков, растения, имеющие более высокую пищевую ценность, растения с измененным вкусом плодов и т. д. Некоторые растения удалось модифицировать так, что они стали своеобразными фабриками по крупномасштабному синтезу ценных белков, например антител. Многочисленные трансгенные растения с измененными свойствами и повышенной пищевой ценностью прошли успешную проверку в лабораторных, а некоторые из них — в полевых условиях, К настоящему времени на рынок поступило лишь небольшое число генетически модифицированных растений, однако можно с уверенностью сказать, что в будущем они займут на нем достойное место.

ЛИТЕРАТУРА

Ananda Kumar Р., R. P. Sharma, V. S. Malik. 19%, The insecticidal proteins of Bacillus thuringïensis. Adv. Appl. Microbiol. 42: 1—43.

Anderson E. J., D. M, Stark, R. S. Nelson, N. E. Turner, R. N. Beaehy. 1989. Transgenic plants that express the coat protein gene of TMV or A1MV interfere with disease development of non-related viruses. Phytopathology 12: 1284-1290.

414 ГЛАВА 18

Ayub R., M. Guis, M. Ben Amor, L. Gillot, J.-P. Roustan, A. Latehé, M. Bouzayen, J.-C. Pech. 1996. Expression of ACC oxidase antisense gène inhibits ripening of cantaloupe melon fruits. Nat. Biotechnol. 14: 862-866.

Bachern С. W. В., G.-J. Speckmann, P. С. G. van der Linde, F. T. M. Verheggen, M, D. Hunt, J. C. StefTens, M. Zabeau. 1994. Antisense expression of polyphenol oxidase genes inhibits enzymatic browning in potato tubers. Bio/Technology 12: 1101-1105.

Beachy R. N., S. Loesch-Fries, N. E. Turner. 1990. Coat protein-mediated resistance against virus infection. Annu. Rev. PhytopathoL 28: 451-474.

Bird C. R., D. Grierson, J. A. Ray, W. W. Schuch. October 1993. Tomato plants and cells containing рТОМЗб antisense constructs. U.S. patent 5,254,800.

Boulter D., A. M. R. Gatehouse, V, Hilder. 1989. Use of cowpea trypsin inhibitor (CpTI) to protect plants against insect prédation, Biotechnol. Adv. 7: 489-498.

Bowler C., L· Stooten, S, Vandenbranden, R. De Rycke, J. Botterman, C. Sybesma, M. Van Montagu, D. Inze, 1991. Manganese Superoxide dismutase can reduce cellular damage mediated by oxygen radicals in transgenic plants. EMBQ J. 10: 1723-1732.

Brünfte K. J., R. L. Meeusen. 1991. Insect control with genetically engineered crops. Trends Biotechnol. 9: 197-200.

Cheng J., M. G. Boh/anl, R. C. Saxena, M. B. Sticklen. 1992, Production of insect resistant potato by genetic transformation with a δ-endotoxin from Bacillus thuringiens'ts var. kurstaki. Plant Set. 81: 83-91.

Comai L., D, Facciotti, W. R. Hiatt, G. Thompson, R. E. Rose, D. M. Stalker 1985. Expression in plants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium confers tolerance to glyphosate. Nature 317: 741-744.

Corbin D. R., J. T. Greenplate, E. Y. Wong, J. Purcell. 1994. Cloning of an insecticidal cholesterol oxidase gene and its expression in bacteria and in plant protoplasts. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4239-4244.

Courtney-Gutterson N., C, Napoli, C. Lemieux, A. Morgan, E. Firoozabady, K. E. P. Robinson. 1994. Modification of flower color in florist's

Chrysanthemum: production of a white-flowering variety through molecular genetics.

Bio/Technology 12: 268-271.

Cuozzo M., K. M. O'Connell, W. Kaniewski, R.-X. Fang, N.-H. Chua, N. E. Turner. 1988. Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic virus coat protein or its antisense RNA. Bio/Technology 6: 549-557.

Day A. G., E. R. Bejarano, K. W. Buck, M. Burrell,

C.P. Lichtenstein. 1991. Expression of an anti-sense viral gene in transgenic tobacco confers resistance to the DNA virus tomato golden mosaic virus. Proc. Natl. Acad. Sa. USA 88: 67216725.

Dekker J., S. O. Duke. 1995. Herbicide-resistant field crops. Adv. Agron. 54: 69—116. Detennay X., B. J. LaVaUee, R. K. Proksch, R. L, Fuchs, S. R. Sims, J. T. Greenplate, P.

G. Marrone, R. B. Dodson, J. J. Augustin^, J. G. Layton,

D.A. Fischhoff. 1989. Field performance of transgenic tomato plants expressing the Bacillus thuringiensis var. kurstakî insect control protein. Bio/Technology 7': 1265-1269.

Duan X., X. Li, Q. Xue, M. Abo-FJ-Saad, D. Xu, R. Wu. 1996. Transgenic rice plants harboring an introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant. Nat. Biotechnol. 14:494—498.

During K., P. Porseh, M. Fladung, H. Lorz. 1993. Transgenic potato plants resistant to the phy-topathogenic bacterium Erwinia carotovora. Plant. J. 3: 587-598.

Ely S. 1993. The engineering of plants to express Bacillus thuringiensis δ-endotoxins, p. 105124. in P. F. Entwistle, J. S, Cory, M. J. Bailey, S. Higgs (ed.), Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: Theory and Practice. John Wiley & Sons, Chichester, United Kingdom.

Falco S. C., T. Guida, M. Locke, J. Mauvais,

C.Sanders, R. T. Ward, P, Webber. 1995, Transgenic canola and soybean seeds with increased lysine. Bio/Technology 13: 577-582.

Fiedler U., U. Conrad. 1995. High-level production and long-term storage of engineered antibodies in transgenic tobacco seeds. Bio/Technology 13: 1090-1093.

Fischhoff D. A., K. S. Bowdish, F. J. Perlak, P. G. Marrone, S. M. McConnick, J. G.

Nfedermeyer,

D.A. Dean, K. Kunsano-Kretzner, E. J. Mayer,

D. E. Rochester, S. G. Rogers, R. T. Fraley.

1987. Insect tolerant tomato plants. Bio/Technology 5: 807-813.

Fitchen J. H., R. N. Beachj. 1993. Genetically engineering protection against viruses in transgenic plants. Annu. Rev. Microb'tol. 47: 739—763.

Fuchs M., D. Gonsalves. 1995. Resistance of transgenic hybrid squash Z\V-20 expressing the coat protein genes of zucchini yellow mosaic virus and watermelon mosaic virus 2 to mixed infections by both potyviruses. Bio/Technology 13:1466-1473.

Gray J. E., S. Picton, J, J. Giovannoni, D. Grierson. 1994. The use of transgenic and naturally occurring mutants to understand and manipulate tomato fruit ripening. Plant Cell Environ. 17: 557-571.

Grison R., B. Grezes-Besset, M. Schneider, N. Lucante, L. Olsen, J.-J. Lcguay, A. Toppan.

1996. Field tolerance to fxmgal pathogens of Brassica napus constitutively expressing a chimeric chitinase gene. Nat. Biotechnol. 14: 643-646.

Hilder V. A., A. M. R. Gatehouse, S. E. Sheerman, R. F. Barker, D. Boulter. 1987. A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature 330: 160-163.

Hill K. K., N. Jarvis-Eagan, E. L. Halk, K. J. Krahn, L. W. Liao, R. S. Mathewson, D. J. Merlo, S. E. Nelson, K. E. Rashka, L. S. Loesch-Fries.

1991. The development of virus-resistant alfalfa, Medtcago saliva L. Bio/Technology 9: 373—377.

Holton Τ. Α., F. Bniguera, D. R. Lester, Y. Tanaka, C. D. Hyland, J. G. T. Menting, C.-Y. Liu, E. Farcy, T. W. Stevenson, E. C. Cornish. 1993. Cloning and expression of cytochrome P450

genes controlling flower color. Nature 366: 276—279.

Johnson R., J. Narvaez, G. An, C. Ryan. 1989. Expression of protease inhibitors 1 and II in transgenic tobacco plants: effects on natural defense against Manduca sexta larvae. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 9871-9875.

Jongedijk E., A. A. J. M. de Schutter, T. Stolte, P. J. M. van den Elzen, B. J. C. Cornelissen, 1992. Increased resistance to potato virus X and preservation of cultivar properties in transgenic

potato under field conditions. Bio/Technology 10: 422-429.

Klee H. J., M. B. Hayford, K. A. Kretzmer, G. F. Barry, G. M. Kishore. 1991. Control of ethylene synthesis by expression of a bacterial enzyme in transgenic tomato plants. Plant CW/3:

11871193.

Knutzon D. S., G. A. Thompson, S. E. Radke, W. B. Johnson, V. С Knauf, J. С. Kridl. 1992. Modification of Brassica seed oil by antisense expression of a stearoylacyl carrier protein desaturase gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:2624-2628.

Lee W. S., J. T. C. Tzen( J. C. Kridl, S. E. Radke, A. H. C. Huang. 1991. Maize oleosin is correctly targeted to seed oil bodies in Brassica napus transformed with the maize oleosin gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 6181-6185.

Lilius G., N. Holmberg, L. Bülow. 1996. Enhanced NaCl stress tolerance in transgenic tobacco expressing bacterial choline dehydrogenase. Bio/Technology 14: 177-180.

Lin W., C. S. Anuratha, K. Datta, I. Potrykus, S. Muthukrishnan, S. K. Datta. 1995. Genetic engineering office for resistance to sheath blight. Bio/Technology 13: 686-691.

Ling K., S. Namba, C. Gonsalves, J. L· Slightom, D. Gonsalves. 1991. Protection against detrimental effects of potyvirus infection in transgenic tobacco plants expressing the papaya ringspot virus coat protein gene. Bio/Technology 9:752-758.

Lodge J. K., W. K. Kaniewski, N. E. Turner. 1993. Broad-spectrum virus resistance in transgenic plants expressing pokeweed antiviral protein. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 90: 7089-7093.

Ma J. K.-C., M. B. Hein. 1995. Immunotherapeutic potential of antibodies produced in plants.

Trends Biotechnol. 13: 522-527.

Macintosh S. C., G. M. Kishore, F. J. Perlak, P. G. Marrone, T. B, Stone, S, R. Sims, R. L. Fuchs. 1990. Potentiation of Bacillus thuringien-sis insecticidal activity by serine protease inhibitors. J. Agric. FoodChem.SS: 1145-1152.

Meyer P., I. Heidmann, G. Forkmann, H. Saedler. 1987. A new petunia flower colour generated by transformation of a mutant with a maize gene. Nature 330: 677-678.

Mol J. N. M., T. A. Holton, R. E. Koes. 1995. Floriculture: genetic engineering of commercial traits. Trends Biotechnol. 13: 350-355.

Mol J. N. M., A. R. van der Krol, A. J. van Tunen, R. van Blokland, P. de Lange, A. R. Stuitje.

1990. Regulation of plant gene expression by antisense RNA. FEBSLett. 268:427-430.

Murphy D. J. 1996. Engineering oil production in rapeseed and other oil crops. Trends Biotechnol. 14:206-213.

Nawrath C., Y. Poirier, С. Somerville. 1994. Targeting of polyhydroxybutyrate biosynthetic pathway to the plastids of Arabtdopsts thaliana results in high levels of polymer accumulation. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 91: L2760-12764.

Panarrubia L., R. Ют, J. Giovannoni, S.-H. Kim, R. L· Fischer. 1992. Production of the sweet protein monellin in transgenic plants. Bio/Technology 10: 561-564.

Perlak F. J., R. W. Deaton, T. A. Armstrong, R. L. Fuchs, S, R. Sims, J. T. Greenplate, D. A- Fischhoff. 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technolog}'8: 939-943.

IVrlak l·. J., R. L Fuchs, D. A. Dean, S. L. McPherson, D. A. Fischhoff. 1991. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes. Proc. NatL Acad, Sei. USA

88:3324-3328.

Powell P. A., D. M. Stark, P. R. Sanders, R. N. Beachy. 1989. Protection against tobacco mosaic

virus in transgenic plants that express tobacco mosaic virus antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA

86:6949-6952.

Quinn J. P. 1990. Evolving strategies For the genetic engineering of herbicide resistance in plants.

Biotechnol. Adv. 8: 321-333.

Rooijen G. J. H., M. M. Moloney. 1995. Plant seed oil-bodies as carriers for foreign proteins.

Bio/Technology 13: 72-77.

Ryan C, A. 1990. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insect and pathogens. Annu. Rev.Phytopathol 28: 425-449.

Sen Gupta A., R. P. Webb, A. S. Holaday, R. D. Allen. 1993. Overproduction of Superoxide dismutase protects plants from oxidative stress. Plant Physiol. 103: 1067-1073.

Shade R. E., H. E. Schroeder, J. J. Pueyo, L. M. Tabe, L. L. Murdock, T. J. V. Higgins, M. J. Chrispeels. 1994. Transgenic pea seeds expressing the tx-amylase inhibitor of the common bean are resistant to bruchid beetles. Bio/Technology 12: 793-796.

Shah D. M., C. M. T. Rommens, R. N. Beachy. 1995. Resistance to diseases and insects in transgenic plants: progress and applications to agriculture. Trends Bioiechnol. 13: 362-368.

Töpfer R., N. Martini, J. ScheU. 1995. Modification of plant lipid synthesis. Science 268:681—686. Tricoli D. M., K. J. Carney, P. F. Russell, J. R. MeMaster, D. W. Groff, K. C. Hadden, P. T.

Himmel, J. P. Hubbard, M. L. Boeshore, H. D. Quemada. 1995. Field evaluation of transgenic squash containing single or multiple virus coat protein gene constructs for resistance to cocumbcr mosaic virus, watermelon mosaic virus 2, and zucchini yellow mosaic virus. Bio/Technology 13: 1458-1465.

Vaeck M., A. Reynaerts, H. HOfte, S. Jansens, M. de Beuckeleer, C. Dean, M. Zabeau, M. Van Montagu, J. Leemans, 1987. Transgenic plants protected from insect attack. Nature 328: 33-37.

Van Camp W., H. WDtekens, C. Bmrter, M. Van Montagu, D. Inzé, P. Reupold-Popp, H. Sandermann, Jr., C. Langebartels. 1994. Elevated levels of Superoxide dismutase protect transgenic plants against ozone damage, Bio/Technology 12: 165-168.

Van Rie J. 1991. Insect control with transgenic plants: resistance proof? Trends Bioiechnol. 9: 177179.

Vierheilig H., M. Alt, J.-M. Neuhaus, T. Boiler, A. Wiemken. 1993. Colonization of transgenic Nicotiana syivestris plants, expressing different forms of Nicotiana tabacum chitinase, by the root pathogen Khizoctonia solant and by the myeor-rhizal symbiont Glomus mosseae. Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 261-264.

Williams S., L. Friedrich, S. Dincher, N. Carozzi, H. Kessmann, E. Ward, J. Ryals. 1992. Chemical regulation of Bacillus thuringiensis 6-endotoxin expression in transgenic plants. Bio/Technology 10: 540-543.

Zhu Q., E. A. Mäher, S. Masoud, R. A. Dixon, С J. Lamb. 1994. Enhanced protection against fungal attack by constitutive co-expression of chitinase and glucanase genes in transgenic tobacco.

Bio/Technology 12: 807-812.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Предположим, что растения инфицированы вирусом без оболочки с одноцепочечным РНК-геномом (8000 нуклеотидов). Вирус и его РНК. можно легко выделить. Кроме того,

у вас есть антитела ко всем четырем вирусным белкам. Какую стратегию вы выбрали бы для защиты растений от вирусной инфекции?

2.Предложите несколько стратегий создания растений, устойчивых к насекомымвредителям.

3.Как с помощью антисмысловой РНК можно обеспечить устойчивость растений к специфическим вирусам?

4.Каким образом ингибиторы протеиназ, ингибитор амилазы и холестеролоксидаза защищают растения от насекомых-вредителей?

5.Предложите стратегию защиты растений от повреждения несколькими разными вирусами.

6.Опишите основные способы создания растений, устойчивых к гербицидам.

7.Как следует изменить растение, чтобы обеспечить его защиту от патогенных почвеных грибов?

8.Как с помощью генной инженерии получить растения, устойчивые к патогенным бактериям?

9.Какой подход вы применили бы для создания растения, толерантного к высоким концентрациям солей?

10.Предположим, что вам нужно замедлить созревание плодов авокадо при их транспортировке. Какой способ вы выберете?

11.Как с помощью методов генной инженерии получить растения с необычной окраской цветков?

12.Как с помощью генной инженерии повысить содержание лизина в сое?

13.Что такое косупрессия? Антисмысловая супрессия? Сравните их.

14.Как упростить процедуру очистки растворимых белков, например фрагментов антител, синтезируемых растениями?

ГЛАВА 19. Трансгенные животные

Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным" геном может нести также и «вредные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно новую стратегию.

Успешные эксперименты по введению чужеродных генов в клетки млекопитающих и возможность создания генетически идентичных животных путем переноса ядра из эмбриональной клетки в яйцеклетку с удаленным ядром (перенос ядра, клонирование) позволили включать в хромосомную ДНК высших животных отдельные функциональные гены или целые их кластеры. Используемая стратегия состоит в следующем.

•Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.

•Инокулированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно).

•Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках.

•Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Такой подход имеет много практических приложений. Например, если продукт вводимого гена стимулирует рост, то трансфицированные животные будут расти быстрее при меньшем количестве пищи. Повышение эффективности усвоения пищи всего на несколько процентов может существенно снизить стоимость конечного продукта (говядины, свинины и т. д.).

Идея генетического изменения животных путем введения генов в оплодотворенные яйцеклетки была реализована на практике в 1980-х гг. Как и во многих других новых областях науки, для упрощения обмена информацией между учеными был введен ряд новых терминов. Так, животное, чей генотип был изменен путем введения чужеродной (экзогенной) ДНК, было названо трансгенным, вводимая ДНК - трансгеном, а весь процесс - трансгенной технологией, или трансгенозом.

Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее трансгеноз стал мощным инстру-

Таблица 19.1. Белковый состав (г/л) молока коров и овец

ментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин «фарминг», относящийся к процессу получения из молока трансгенных домашних ("pharm") животных аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые по крайней мере близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока, которое содержит и другие белки (табл. 19.1), не должно составлять большого труда.

Трансгенные мыши: методология

Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в значительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухолей, природы иммунологической специфичности, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процессов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трансгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека. Введение чужеродной ДНК мышам можно осуществить разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Использование ретровирусных векторов

Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис. 19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего транс ген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность.

Метод микроинъекции ДНК

В настоящее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем (рис. 19.2).