Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

ЧАСТЬ III.

Эукариотические

системы

До недавнего времени высокопродуктивные сорта сельскохозяйственных растений и новые породы животных получали методом селекции. Однако этот подход, требующий для своей реализации много времени, уступил место методам, основанным на генной инженерии высших организмов. Теперь гены, обусловливающие специфические признаки, могут вводиться в клетки растений или животных и передаваться следующим поколениям (наследоваться). В ч. III мы рассмотрим, как получаются такие трансгенные растения и животные.

Уже создано несколько видов трансгенных растений, обладающих признаками, которые детерминируются генами, введенными в них генноинженерным и методами. К числу таких признаков относятся: способность синтезировать инсектициды; устойчивость к вирусным инфекциям и гербицидам; измененные сроки созревания плодов; измененная окраска цветков; повышенная пищевая ценность семян и самонесовместимость. Исследования трансгеноза у животных только начинаются, так что пока трудно предсказать, какие генетические признаки будут наследоваться видом-реципиентом. К настоящему времени выведены линии трансгенных мышей, которые используются как модельные системы для изучения механизма возникновения рака, муковисцидоза, болезни Альцгеймера и других заболеваний человека.

Технология рекомбинантных ДНК нашла широкое применение в изучении наследственных болезней человека и раз-

работке методов генной терапии. Так, используя специфический хромосомный сайт в качестве маркера, можно локализовать на хромосоме человека ген, ассоциированный с данным заболеванием, ничего не зная о механизме действия этого гена, а затем, используя клонированную последовательность, которая узнает этот маркерный сайт, попытаться идентифицировать дефектный ген. С помощью такого подхода уже были найдены и охарактеризованы гены некоторых болезней человека. Далее можно исследовать механизм действия нормального и дефектного генов и разработать эффективные методы лечения. В ч. III обсуждаются молекулярная генетика человека и генная терапия.

ГЛАВА 17.

Генная инженерия растений: методология

Одной из основных задач селекционеров было получение высокоурожайных сортов растений с повышенной пищевой ценностью. Наибольшее внимание уделялось при этом таким зерновым культурам, как кукуруза, пшеница и рис, однако были осуществлены программы и по скрещиванию других сельскохозяйственных и садовых культур. В качестве важного инструмента прямого генетического воздействия на растения применяется технология рекомбинантныхДНК, широко использующаяся в микробиологических системах. К настоящему времени разработано несколько эффективных систем переноса ДНК и экспрессирующих векторов, которые работают в ряде растительных клеток. Одним из достоинств последних является их тотипотентность: из одной клетки может быть регенерировано целое растение, так что из клеток, сконструированных генноинженерными методами, можно получить фертильные растения, все клетки которых несут чужеродный(е) ген(ы) (трансгенные растения). Если такое растение цветет и дает жизнеспособные семена, то желаемый признак передается последующим поколениям.

Можно привести три основных аргумента в пользу получения трансгенных растений. Вопервых, введение гена (генов) часто приводит к повышению сельскохозяйственной ценности и декоративных качеств культурных растений. Во-вторых, трансгенные растения могут служить живыми биореакторами при малозатратном производстве экономически важных белков или метаболитов. В-третьих, генетическая трансформация растений (трансгеноз) позволяет изучать действие генов в ходе развития растения и других биологических процессов.

Некоторые генетически обусловленные признаки — такие как инсектицидная активность, устойчивость к вирусным заболеваниям и гербицидам, замедление старения, устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды, измененная окраска цветков, повышенная пищевая ценность семян и самой есовмести-мостъ — могут быть приобретены растением при введении в него одного или нескольких генов. На сегодняшний день уже получены многочисленные трансгенные растения на основе как культурных, так и диких видов. Биотехнология несомненно внесет коррективы втрадиционные программы разведения растений, в рамках которых для выведения нового сорта требуется от 10 до 15 лет. А в будущем с ее помощью можно будет создавать растения с совершенно новыми характеристи ками.

Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens

Грамотрицательная почвенная бактерия

Agrobacterium tumefaciens — фитопатоген, который в процессе своего жизненного цикла трансформирует клетки растений. Эта трансформация приводит к образованию корончатого галла - опухоли, нарушающей нормальный рост растения (рис. 17.1). Этой болезни, имеющей серьезные агрономические последствия, подвержены только двудольные растения, в частности виноград, косточковые фруктовые деревья, розы.

Образование корончатого галла начинается с проникновения, интеграции в геном растительных клеток и экспрессии специфического сегмента бактериальной плазмидной ДНК — так

Рис. 17.1. Инфицирование растений A. tumefaciens и Рис. 17.2. Структурные формулы ацетосирингона и образование корончатого галла. гидроксиацетосирингона. Эти соединения выделяются растением в ответ на повреждение и

активируют vir-гены Ti-плазмиды.

называемой Т-ДНК (от англ, transferred DNA). Т-ДНК — это часть плазмиды, индуцирующей развитие опухоли (tumor-inducing plasmid, Ti-плазмиды); ее несут большинство штаммов A. tumefaciens.

Длина Т-ДНК варьирует от 12 до 24 т. п. н. в зависимости от штамма. Штаммы A. tumefaciens, не содержащие Ti-плазмиды, не способны индуцировать развитие корончатого галла.

Инфекционный процесс начинается с прикрепления A. tumefaciens к клеткам растения в месте повреждения, часто у основания стебля (у корневой шейки). Ранее предполагалось, что A. tumefaciensзаражает именно поврежденные растения вследствие разрушения клеточной стенки и устранения физического барьера, затрудняющего проникновение бактерий в клетку. Однако сейчас считается, что все дело в специфических фенольных соединениях, ацетосирингоне и гидроксиацетосирингоне (рис. 17.2), которые выделяет поврежденное растение. Эти соединения сходны с некоторыми продуктами основного пути синтеза у растений вторичных метаболитов, таких как лигнииы и флавоноиды. Ацетосирингон и гидроксиацетосирингон активируют гены вирулентности (νir), которые локализованы в участке Ti-плазмиды длиной 35 т. п. н., находящемся за пределами Т-ДНК. Продукты vir-генов необходимы для транспорта и интеграции Т-ДНК (рис. 17,3) в геном растительной клетки. Существуют по меньшей мере семь разных νir-генов.

Рис. 17.3. Генетическая карта Ti-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина. которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках. За пределами Т-ДНК находится кластер vir-генов, ген(ы), кодирующий(е) фермент(ы) катаболизма опина, и сайт инициации репликации (ori), который обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в A. tumefaciens, Л и Π — левая и правая фланкирующие последовательности соответственно.

Рис. 17.4. Биосинтез ауксина и цитокинина при участии ферментов, кодируемых генами Т-ДНК Tiплазмиды A. tumefaciens, А. Синтез ауксина начинается с превращения триптофана в индолил-3-ацетамид, катализируемого триптофан монооксигеназой. Затем происходит превращение индолил-3-ацетамида в индолилуксусную кислоту ферментом индолил-3-ацетамидгидролазой. Б. Синтез цитокинина включает присоединение изопентенильной группы изопентенилдифосфата к 5'-АМР при участии фермента изопентенилтрансферазы с образованием изопентениладенозинмонофосфата.

мов не способны использовать опины как источник углерода. Таким образом, в процессе эволюции выработался уникальный набор механизмов, посредством которых каждый штамм A. tumefaciens генетически трансформирует растительные клетки в «биологические фабрики» по производству соединений углерода, использовать которые могут только сами эти бактерии.

Векторные системы на основе Τi-плазмид

Самый простой способ использования природной способности Ti-плазмид к генетической трансформации растений предполагает встраивание интересующей исследователя нуклеотидной последовательности в Т-ДНК, а затем использование Tiплазмид и A. tumefaciens для доставки и встраивания клонированного гена (генов) в геном компетентной растительной клетки. Однако, несмотря на то что Ti-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования.

•Фитогормоны, синтезируемые трансформированными клетками в культуре, подавляют регенерацию из этих клеток зрелого растения, поэтому при конструировании векторов на основе Ti-плазмиды гены ауксина и цито-кинина должны быть удалены.

•Ген опина несуществен для трансгенных растений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Следовательно, при создании векторов ген опина также должен быть удален.

•Ti-плазмиды имеют очень большой размер (от 200 до 800 т. п. н.), а для экспериментов

срекомбинантными ДНК нужны векторы меньшего размера, поэтому участки ДНК, несущественные для клонирующего вектора, должны быть удалены.

•Ti-плазмиды не реплицируются в Escherichia coli, что исключает работу с рекомбинантными Ti-плазмидами в этих бактериях. Следовательно, при конструировании векторов на

основе Ti-плазмид необходимо ввести в них сайт инициации репликации, обеспечивающий их поддержание в E. coli.

Несмотря на все эти сложности было сконструировано несколько векторов для растительных клеток. Все векторы на основе Ti-плазмид организованы сходным образом и имеют следующие элементы.

•Селективный маркерный ген, например ген неомицинфосфотрансферазы, который обеспечивает устойчивость трансформированных растительных клеток к канамицину. Поскольку этот ген (как и многие другие маркерные гены, используемые при трансформации растений) по своей природе прокариотический, необходимо поставить его под контроль растительных (эукариотических) сигналов регуляции транскрипции, в том числе промотора и сигнала терминации-полиаденилирования. Это обеспечит эффективную экспрессию гена в трансформированных растительных клетках.

•Сайт инициации репликации, который позволяет плазмиде реплицироваться в E. coli. Некоторые векторы содержат также и сайт инициации репликации A. tumefaciens.

•Правая фланкирующая последовательность Т-ДНК. Этот элемент абсолютно необходим для интеграции Т-ДНК в клеточную ДНК растений. Большинство же векторов содержат как правую, так и левую фланкирующие последовательности.

•Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания гена в участок между границами Т-ДНК.

Поскольку клонирующие векторы не содержат генов vir, они сами не способны обеспечивать транспорт и интеграцию Т-ДНК в клетки растения-хозяина. Чтобы решить эту проблему, было разработано два подхода. В первом случае используют бинарную векторную систему (рис. 17.6, А). Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации и для E. coli, и для A. tumefaciens, но не несет генов vir, т. е. это практически челночный вектор E, coli — A. tumefaciens. Все стадии клонирования прово-

дят в Е. соli, а затем вектор вводят в A. tumefaciens. Штамм-реципиент A. tumefaciens несет модифицированную неонкогенную («разоруженную») Ti-плазмиду; она содержит полный набор vir-генов, но из нее удалена часть (или вся) Т-ДНК (так что Т-ДНК не может быть транспортирована). В этой системе на неонкогенной Ti-плазмиде синтезируются продукты vir-генов, которые мобилизуют участок Т-ДНК бинарного клонирующего вектора. Продуцируя белки, кодируемые vir-генами, неонкогенная Ti-плазмида выступает в роли помощника, способствуя встраиванию Т-ДНК из бинарного клонирующего вектора в хромосомную ДНК растения.

Во втором случае используют коинтегративную векторную систему. Векторная ДНК рекомбинирует в A. tumefaciens с «разоруженной» Ti-плазмидой, Т-ДНК которой не несет опухолеродных генов, таким образом, что весь клонирующий вектор встраивается в неонкогенную Ti-плазмиду (рис. 17.6, Б). Коинтегративный вектор и неонкогенная Ti- плазмида-помощник содержат гомологичные последовательности, которые образуют сайт для гомологичной рекомбинации in vivo. Обычно эти последовательности расположены в Т- ДНК. После рекомбинации клонирующий вектор становится частью неонкогенной Tiплазмиды, которая содержит vir-гены, необходимые для переноса Т-ДНК в растительную хозяйскую клетку. Единственный способ поддержания клонирующего вектора в A. tumefaciens — это использование такой коинтегративной структуры. В данной конфигурации генетически сконструированный участок Т-ДНК может быть перенесен в растительные клетки.

Физические методы переноса генов в растительные клетки

Системы переноса генов с помощью A. tumefaciens эффективно работают только в случае некоторых видов растений. В частности, однодольные растения, включая основные зерновые культуры (рис, пшеницу и кукурузу), практически не трансформируются A. tumefaciens. Тем не менее, модифицировав методики и тщательно контролируя условия, удалось трансформировать кукурузу и рис агробактериями A. tumefaciens, несущими векторы -- производные Ti-плазмид. Так, например, незрелые зародыши кукурузы помещали на несколько минут в суспензию клеток A. tumefaciens, а затем инкубировали несколько дней в отсутствие селективного давления. После этого зародыши переносили в среду с антибиотиками, в которой могли расти только трансформированные растительные клетки. Эти клетки выдерживали в темноте в течение нескольких недель, затем переносили массу трансформированных растительных клеток на другую питательную среду и инкубировали на свету, чтобы произошла регенерация целого трансгенного растения.

В табл. 17.1 перечислен ряд методов трансформации однодольных растений. Некоторые из этих методов требуют удаления клеточной стенки с образованием протопластов. Последние поддерживают в культуре как независимо растущие клетки или в специальной питательной среде, где они образуют клеточные стенки; из таких клеток может быть регенерировано целое растение. Кроме того, разработаны методы трансформации, позволяющие вводить клони-

Рис. 17.6. Две векторные системы на основе Ti-плазмид, А. Бинарный клонирующий вектор содержит сайты инициации репликации (ori) и для Е. coli, и для A. tumefaciens (либо сайт инициации репликации для широкого круга хозяев), селективный маркерный ген, который может быть использован либо в E. coli, либо в A. tumefaciens, а также интересующий исследователя ген и растительный селективный маркерный ген, встроенные в Т-ДНК. Б. Коинтегративный клонирующий вектор (вверху} содержит сайт инициации репликации только для Е. coll и не может автономно существовать в A, tumefaciens. Он также несет селективный маркерный ген, который используется либо в E. coli, либо в А. tumefaciens, правую фланкирующую последовательность Т-ДНК (П). растительный селективный маркерный ген, ген, который нужно ввести в геном, и фрагмент Τΐ-плазмиды, гомологичный участку ДНК неонкогенной («разоруженной») Τί-плазмиды. Неонкогенная Ti-плазмида (в середине) содержит левую фланкирующую последовательность Т-ДНК (Л), кластер vir-генов и сайт инициации репликации A, tumefaciens (ori). Гомологичная рекомбинация коинтегративного клонирующего вектора с неонкогенной Ti-плазмидой дает рекомбинантную плазмиду (внизу), которая несет клонированный ген и растительный репортерный ген, фланкированные правой и левой концевыми последовательностями Т-ДНК.

Таблица 17. 1. Методы введения ДНК в клетки растений

Метод

Использование Tï-плазмид

Бомбардировка микрочастицами

Использование векторов на вирусов

Прямое введение генов в протопласты Может использоваться для введения генов только в протопласты

Таблица 17.2. Генетически трансформированные растения

рованный ген в небольшое число клеток растительной ткани, из которой можно регенерировать целое растение, обходясь без регенерации из протопластов. В настоящее время для доставки ДНК в клетки растений предпочитают использовать либо векторы на основе Ti-плазмид, либо бомбардировку микрочастицами (табл. 17,1). Таким способом было генетически трансформировано более 50 различных видов растений (табл. 17.2).

Бомбардировка микрочастицами

Бомбардировка микрочастицами, или биолис-тика, — наиболее многообещающий метод введения ДНК в растительные клетки. Золотые или вольфрамовые сферические частицы диаметром 0,4—1,2 мкм покрывают ДНК, осажденной СаС12, спермидином или полиэтиленгликолем, и «выстреливают» ими в клетки из специального «ружья», приводимого в действие газами, образующимися при сгорании пороха, сжатым воздухом или гелием. Частицы разгоняются до скорости 300—600 м/с и пробивают клеточную стенку и мембраны растительной клетки. При этом их плотность такова, что клетки практически не повреждаются.

Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, каким-то неизвестным способом интегрируется в растительную ДНК. Метод бомбардировки микрочастицами позволяет трансформировать растения самых разных видов, в том числе однодольные и хвойные, в которые не удается ввести ДНК с помощью Agrobacterium.

Бамбардировку микрочастицами можно использовать также для введения чужеродной ДНК в суспензию растительных клеток, культуры клеток, меристематические ткани, незрелые зародыши, протокормы, колеоптили и пыльцу широкого круга растений (табл. 17.3). Кроме того,