97. Методы количественного определения вирусов животных в культуре клеток (метод бляшек, выявления вирусных антигенов, реакция гемагглютинации).

1)Метод бляшек - технически сложнее других, в основном применяется для титрования. Основан на образовании вирусом негативных колоний или бляшек в однослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краситель — нейтральрот.

-Бляшки - обесцвеченные участки культуры, состоящие из погибших под действием вируса клеток. В целях предотвращения переноса вируса на другие места можно использовать агар, крахмал и метилцеллюлозу. (Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия слоем агара, например вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые представители вирусов герпеса и др.)

-При постановке бляшек особое внимание должно быть обращено на качество культуры, она должна иметь сплошной рост клеток без признаков дегенерации. Лучше всего использовать культуры, выращенные во флаконах или матрасах различного типа.

-Метод: 1) На клетки, промытые средой или раствором Хенкса, наносят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками при периодическом покачивании в точно установленный отрезок времени (1-2ч) при 37 -38 градусах Цельсия.

2)Неадсорбировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хэнкса или отсасывают пастеровской пипеткой, затем на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие (его компоненты: агар, раствор Эрла, телячья сыворотка, нейтральный красный, раствор соды (NaHC03), среда, антибиотики). Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса.

3) После застывания (30—60 мин) с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх. Время инкубации и температура должны быть оптимальными для бляшкообразования, вызываемого данным вирусом.

4) Наблюдение за появлением бляшек проводят в течение нескольких дней: в это время вирусы, адсорбировавшиеся на клетках, проникают в них, проходят цикл репродукции, выходят из клеток и поражают соседние. В сплошном слое живых клеток возникают островки мертвых, погибших вследствие репродукции в них вируса клеток.

-Раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные пятна, которые и называются негативными пятнами Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка соответствует островку мертвых клеток. Бляшки в культуре клеток образуют многие вирусы. При большой плотности (соответствующей низким разведениям вируса) они часто сливаются друг с другом. Время появления и морфология бляшек зависят от вида и штамма вируса, типа клеток и условий культивирования.

2)Методы, где используется выявление вирусных антигенов:

Анализ однократной радиальной иммунодиффузии (SRID), также известный как метод Манчини, представляет собой анализ белка, который определяет количество специфического вирусного антигена с помощью иммунодиффузия в полутвердой среде (например, агаре). Среда содержит антисыворотку , специфичную к представляющему интерес антигену, и антиген помещен в центр диска. По мере того, как антиген диффундирует в среду, он создает кольцо осадка, которое растет до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Время анализа может составлять от 10 часов до дней в зависимости от времени уравновешивания антигена и антитела. Диаметр зоны от кольца линейно связан с логарифмом концентрации белка и сравнивается с диаметрами зоны для известных стандартов белка для количественного определения. Для этого анализа коммерчески доступны наборы и сыворотки (например, The Binding Site Inc.)

Иммуноферментный анализ (ELISA)

ELISA - это более современный вариант анализа белка, в котором используются специфические антитела, связанные с ферментом, для обнаружения присутствия неизвестного количества антигена ( т.е. вирус) в образце. Событие связывания антитело-антиген выявляется и / или количественно определяется по способности фермента преобразовывать реагент в обнаруживаемый сигнал, который можно использовать для расчета концентрации антигена в образце. Пероксидаза хрена (HRP) является обычным ферментом, используемым в схемах ELISA из-за его способности усиливать сигнал и повышать чувствительность анализа. Существует много разновидностей или типов анализов ELISA, но в целом их можно классифицировать как непрямой , конкурентный , сэндвич или обратный . Наборы для ELISA коммерчески доступны от множества компаний, и количественная оценка обычно проводится с помощью хромогенных репортеров или флуоресценции (например, Invitrogen, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Этот метод намного менее трудоемок, чем традиционные методы, и может занять от 4 до 24 часов в зависимости от времени инкубации антител.

3) Анализ гемагглютинации (НА) представляет собой обычный нефлуоресцентный количественный анализ белка, специфичный для гриппа . Он основан на том факте, что гемагглютинин , поверхностный белок вирусов гриппа, агглютинирует красные кровяные тельца (то есть заставляет красные кровяные тельца слипаться). В этом анализе разведения образца вируса гриппа инкубируют с 1% -ным раствором эритроцитов в течение одного часа и визуально определяют разведение вируса, при котором происходит первая агглютинация. Анализ дает результат в единицах гемагглютинации (HAU) с типичным отношением БОЕ к HAU в диапазоне 10. Этот анализ занимает ~ 1-2 часа, а результаты могут сильно отличаться в зависимости от технических знаний оператора.

Анализ ингибирования гемагглютинации представляет собой обычный вариант анализа HA, используемый для измерения уровней грипп-специфических антител в сыворотке крови. В этом варианте сывороточные антитела к вирусу гриппа будут препятствовать прикреплению вируса к эритроцитам. Следовательно, гемагглютинация подавляется, когда антитела присутствуют в достаточной концентрации.