19. Получение вирус содержащего материала от больных животных и трупов.

Получение и обработка патологического материала. В лабораторной диагностике вирусных болезней точность диагноза прежде всего зависит от правильности взятия патологического материала, его транспортировки, качества приготовления и техники исследования вируссодержащего материала. Материал для исследования от заболевших, павших или вынужденно убитых животных следует брать сразу при появлении выраженных признаков болезни или не позже 2...3 ч после клинической смерти или убоя. В поздние сроки болезни количество вируса может снизиться в результате воздействия защитных механизмов организма.

Общий принцип взятия патматериала для выделения вируса основан на четком представлении о патогенезе предполагаемой инфекции и преимущественной локализации вируса в тех или иных органах или тканях, а также на знании тропизма вируса, входных ворот, путей распространения в организме, путей и сроков его выделения из организма. При респираторных инфекциях (грипп, болезнь Ауески, парагрипп, ларинготрахеит, инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота) для выделения вирусов из организма больного животного берут носоглоточные смывы, мазки из носа и глотки; для выделения энтеровирусов - кал; дермотропных агентов - свежие поражения кожи; при ящуре и оспе - стенки афт, содержимое везикул, пустул; при чуме - кровь и др.

Мазки с конъюнктивы, слизистой оболочки носа, задней стенки глотки, прямой кишки и клоаки у птиц берут стерильными ватными тампонами, которые погружают в пенициллиновые флаконы или пробирки, содержащие 3...5 мл соответствующей жидкости (раствор Хенкса или среда для культур клеток с антибиотиками - пенициллином или стрептомицином из расчета по 500 ЕД на 1 мл среды). Вытекающую изо рта слюну можно собирать в пробирку. Если ее выделяется мало, то пропитывают слюной стерильный тампон на палочке, который затем помещают в пробирку с небольшим количеством физиологического раствора. Мочу собирают с помощью катетера в стерильную посуду. Фекалии берут из прямой кишки с помощью шпателя или палочки и затем помещают в стерильную пробирку или пенициллиновый флакон. Стенки афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом. Спинномозговую жидкость берут асептично с помощью пункции. Для ретроспективной диагностики от каждого животного берут кровь дважды: первый раз в начале или в разгар болезни, второй раз через 2...3 нед. после первого в зависимости от инфекции. Сыворотки крови используют для постановки различных серологических реакций. После смерти животного особенно важно как можно быстрее взять, соблюдая стерильность, кусочки органов, чтобы избежать посмертных изменений тканей (аутостерилизация), а также бактериального обсеменения. В качестве патологического материала чаще всего берут кусочки тех органов (размером в несколько кубических сантиметров), которые имеют видимые отклонения от нормы (форма, размер, цвет, консистенция, наличие необычных образований); могут быть поражены или содержать вирус на основании клинической картины болезни перед смертью или наиболее часто содержат вирус - печень, селезенка, легкие, головной мозг, лимфатические узлы и почки. Пробы органов нервной системы исследуют при подозрении на бешенство, энцефалиты, болезнь Ауески, энцефаломиелиты птиц и другие инфекции. Материал, направляемый для исследования, должен быть помещен в условия (консервация, упаковка проб), обеспечивающие его сохранность и безопасность окружающих. Надежный способ консервации вируссодержащего материала - замораживание, но при этом следует избегать колебаний температуры, особенно резких перепадов, а также повторных замораживаний и оттаиваний. Если замораживание образцов по ряду обстоятельств невозможно, то используют для консервации химические растворы, 50%-й раствор глицерина (глицерин и физиологический раствор в равных объемах); смеси: 1) сухой лед и этиловый спирт в равных объемах; 2) физиологический раствор (33 части) и обычный лед (100 частей). Каждый вируссодержащий материал должен быть снабжен этикеткой с указанием материала и вида животного, названия хозяйства, предварительного диагноза, даты взятия материала и фамилии ветеринарного специалиста.

Подготовка материала для вирусологических исследований. Поступивший для исследования патологический материал регистрируют и подвергают исследованию по трем направлениям: 1) вирусологическое исследование - непосредственное выделение активных форм вируса, его идентификация; 2) экспресс-методы - обнаружение в патматериале вирусного антигена, внутриклеточных включений, гемагглютинина вируса; 3) ретроспективное (серологическое) исследование - обнаружение в сыворотке крови специфических антител и определение их титра в различных реакциях.

Для вирусологических исследований патматериал размораживают. Суспензию из него получают путем растирания в ступке и разведения стерильным физиологическим раствором (1:10). Затем проводят осветление полученной суспензии методом центрифугирования в течение 20 – 30 мин. при 2000 – 3000 об. в мин., после чего надосадочную - вируссодержащую - жидкость отсасывают. В суспензии (жидкости) для подавления посторонней микрофлоры (бактерий, грибов) добавляют антибиотики из расчета от 100 до 2000 ЕД на 1 мл суспензии (доза 100 ЕД/мл - профилактическая, 2000 ЕД/мл - стерилизующая). Обычно используют комбинацию пенициллина и стрептомицина в равных количествах или других антибиотиков. Суспензию с антибиотиками оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Затем проводят бактериологический контроль путем посева этой суспензии на сахарные МПА и МПБ. Полученную суспензию хранят в замороженном состоянии.