этого объекта. Почти одновременно Л. Стадлер (1928) описал влияние рентгеновых лучей на мутационный процесс у ячменя. В том же году М. Н.

Мейсель в лаборатории Г. А. Надсона получил мутации у дрожжей под действием химических соединений (хлороформ и др.).

В 30-х годах открыт химический мутагенез у дрозофилы: сначала В. В. Сахаров (1932), а затем М. Е. Лобашев и Ф. А. Смирнов (1934) показали, что некоторые соединения (йод, уксусная кислота, аммиак) способны индуцировать рецессивные летали в Х-хромосоме. С тех пор в арсенал мутагенных факторов вошли разнообразные химические соединения. Наряду с мутагенами были найдены вещества-антимутагены.

Возможность изменять скорость мутационного процесса послужила решающим стимулом к выяснению причин спонтанных мутаций.

Современная точка зрения на причины спонтанных мутаций сформировалась в 60-х годах благодаря выяснению механизмов воспроизведения, репарации и рекомбинации генов и открытию ферментных систем, ответственных за эти процессы. Возникла тенденция объяснять генные мутации как ошибки в работе ферментов матричного синтеза ДНК. Сейчас эта гипотеза общепризнанна. Она позволяет рассматривать и индуцированный мутационный процесс как результат вмешательства внешних факторов в нормальное воспроизведение носителей генетической информации, т.е. дает единое объяснение причин спонтанных и индуцированных мутаций. Большое влияние на развитие теории мутационного процесса оказало изучение его генетического контроля. Были открыты гены, мутации которых могут повышать или понижать частоту как спонтанных, так индуцированных мутаций.

Генные мутации и причины их возникновения.

О сновное внимание при изучении генных мутаций уделяют изменениям чередования пар нуклеотидов в ДНК и прежде всего изменениям, затрагивающим отдельные пары нуклеотидов, которые составляют класс точковых или точечных мутаций.

Точковые мутации представляют собой изменения пар нуклеотидов ДНК (или нуклеотида РНК). Далее этот класс мутаций подразделяется на следующие группы:

а) транзиции – такие замены пар нуклеотидов (АТ↔СС), которые не изменяют ориентации: пурин

– пиримидин в пределах пары

б) трансверсии – замены пар нуклеотидов(АТ↔СG, АТ↔ТА,

GС ↔СG), изменяющие ориентацию

в) вставка лишней пары нуклеотидов;

г) выпадение пары нуклеотидов.

Одна из причин мутаций – возможность существования оснований ДНК в нескольких таутомерных формах. Если аденин находится в обычной аминной форме, он спаривается с тимином. Будучи в редкой иминоформе, аденин образует пары с цитозином. Этот таутомерный переход аденина при последующей репликации может обеспечивать транзиции

АТ→GС. Редкий енольный таутомер тимина способен образовать пару с гуанином и это также приведет к замене пары нуклеотидов.

Спонтанная мутабильность повышается в результате мутационного изменения генов, контролирующих репликацию ДНК. Мутации некоторых генов, ответственных за репарацию проявляют мутаторный или антимутаторный эффект, подобно мутациям в генах, ответственных за репликативный комплекс.Хромосомные мутации

Их называют также хромосомными перестройками или хромосомными аберрациями. Они представляют собой перемещения генетического материала, приводящие к изменению структуры хромосом в пределах кариотипа. В такие перестройки могут быть вовлечены участки одной хромосомы или разных – негомологичных – хромосом. В соответствии с этим критерием выделяют аберрации внутрихромосомные и межхромосомные. Внутрихромосомные перестройки подразделяют на дефишенси, или концевые нехватки; делеции – выпадения частей хромосомы, не захватывающие теломеру; дупликации, или удвоения (умножения) части хромосомы; инверсии – изменения чередования генов в хромосоме вследствие поворота участка хромосомы на 180°.

Межхромосомные перестройки включают транслокации – перемещения части одной хромосомы на другую, не гомологичную ей.

Особое положение занимают транспозиции и инсерции – изменения локализации небольших участков генетического материала, включающих один или несколько генов. Транспозиции могут происходить как между негомологичными хромосомами, так и в пределах одной хромосомы. Поэтому транспозиции занимают промежуточное положение между внутрихромосомными и межхромосомными перестройками.

С точки зрения цитологически регистрируемых картин аберрации подразделяют на хромосомные и хроматидные. Эта классификация связана исключительно со временем возникновения перестроек – до или после репликации хромосом. Хромосомные перестройки часто приводят к различным фенотипическим изменениям, которые объясняются локализацией точек разрывов внутри или вблизи тех или иных генов.

Вследствие нехваток хромосомы укорачиваются, и физическое отсутствие участка одного из гомологов приводит к гемизиготному состоянию генов, находящихся в нормальном гомологе. Если теряются доминантные аллели одного из гомологов гетерозиготы, то наблюдается фенотипическое проявление рецессивных аллелей хромосомы, не затронутой аберрацией. Делеции обычно летальны в гомозиготе, что указывает на вы-падение каких-либо жизненно важных генов. Очень короткие делеции могут не нарушать жизнеспособности в гомозиготе. Концевые нехватки, или дефишенси, устанавливают по тем же критериям, что и делеции, однако вследствие их расположения при конъюгации не образуется петля, а одна хромосома оказывается короче другой. Примеры дефишенси известны у многих организмов, включая человека. Тяжелое наследственное заболевание синдром кошачьего крика, названное так по характеру звуков, издаваемых больными младенцами, обусловлено гетерозиготностью по дефишенси в 5-й хромосоме. Этот синдром сопровождается умственной отсталостью. Обычно дети с таким синдромом рано умирают.

При отделении фрагмента хромосомы он, как правило, теряется, если не содержит центромеры. Фрагмент, содержащий центромеру, реплицируется и его копии нормально распределяются при клеточных делениях.

Дупликации, в строгом смысле этого слова, представляют собой двукратное повторение одного и того же участка хромосомы. Известны случаи многократных повторений или мультипликаций какого-либо участка. Их называют также амплификациями.

Дупликации могут происходить в пределах одной и той же хромосомы или сопровождаться переносом копии участка генетического материала на другую хромосому. Повторы, возникшие в одной хромосоме, могут распола-гаться тандемно (АВСВСОЕ...) или инвертированно (АВССВОЕ...). Различают также терминальные повторы, если дупликация затрагивает конец хромосомы. По-видимому, главной причиной множественных повторов участков генетического материала является так называемый неравный кроссинговер.

Дупликации и делеции часто возникают в результате разрывов

х ромосом, вызываемых различными повреждающими агентами, ионизирующей радиацией, химическими мутагенами, вирусами и др. Кроме того, дупликации и делеции могут быть результатом кроссинговера у гетерозигот по инверсиям и транслокациям.

Изменение чередования генов в хромосоме в результате инверсии

– тип перестроек, наиболее часто

встречающихся в природных популяциях. В зависимости от

расположенияконцов(границ)

перестройки по отношению к центромере инверсии делят на

перицентрические, захватывающие центромеру, и включающие ее в инвертированный участок, и парацентрические, не включающие центромеру в инвертированный участок.

Инверсии – это широко распространенный путь эволюционного преобразования генетического материала.

Инверсия приводит к изменению сцепления генов, иной их линейной последовательности, нежели у исходной формы. Этот эффект можно обнаружить, если инверсия в гомозиготе не летальна. Рецессивная летальность часто сопутствует инверсиям как результат локализации точек разрывов в жизненно важных генах или как следствие эффекта положения.

Другое важное следствие инверсии – подавление кроссинговера, если инверсия находится в гетерозиготе. Это свойство инверсий широко используют при создании сбалансированных линий, гетерозиготных по летальным мутациям и не разрушаемых кроссинговером по нужной хромосоме. У гетерозигот по инверсиям на цитологических препаратах обнаруживают характерные петли – результат конъюгации структурно измененной и нормальной хромосомы. Если в такой петле, т. е. в инвертированном участке, произойдет одиночный кроссинговер, то возникает одна хроматида с двумя центромерами, которые ее порвут при расхождении в анафазе. Образующийся бесцентромерный фрагмент будет потерян.

Транслокации представляют собой реципрокный обмен участками не гомологичных хромосом. В результате такого обмена у гомозигот по транслокациям изменяется характер сцепления генов. В гетерозиготе по транслокации гены, принадлежащие к разным, негомологичным хромосомам, наследуются как принадлежащие к одной группе сцепления. Это объясняется тем, что полностью функциональными оказываются только те споры (у растений) и гаметы (у животных), которые несут родительские сочетания хромосом.

Характер конъюгации транслоцированных хромосом меняется: образуется фигура креста. Плотная конъюгация вблизи точек разрывов оказывается затрудненной, что приводит к подавлению кроссинговера в этих участках.

• гетерозиготы по транслокации в профазе мейоза образуются квадриваленты, а не биваленты, как обычно, поскольку гомологичные участки оказываются у всех четырех конъюгирующих хромосом. Из шести возможных типов гаплоидных продуктов, возникающих при трех способах расхождения хромосом, только два типа функционируют нормально – те, которые получают полные наборы генов, характерные для исходных родительских форм. Остальные четыре типа несут дупликации и нехватки и потому, как правило, не дают жизнеспособного потомства или не участвуют в оплодотворении.

Особый тип транслокаций, так называемые Робертсоновские транслокации, или слияния, приводит к изменению числа хромосом. Если две акроцентрические хромосомы сливаются в области центромеры, то образуется одна метацентрическая хромосома.

Эффект положения

Довольно часто хромосомные перестройки приводят к изменению фенотипа вследствие того, что переместившиеся гены оказываются в новом окружении. Эффект положения чаще всего сказывается на изменении доминирования гена.

Транспозиции представляют собой перемещение небольших участков генетического материала в пределах одной хромосомы или между разными хромосомами. Транспозиции происходят при участии подвижных или мигрирующих генетических элементов – транспозонов.

Геномные мутации

Всеобъемлющая изменчивость затрагивает любые признаки и любые генетические структуры: гены, хромосомы, геномы. Полиплоидия и анеуплоидия представляют собой результат изменений числа хромосом, которые, согласно традиционной классификации, относят к геномным мутациям, т. е. изменениям генома – гаплоидного набора хромосом с локализованными в них генами. Наряду с последовательными регулярными изменениями плоидности или числа наборов хромосом (2n ↔ n) в жизненных циклах эукариот встречаются случаи сверхнормального умножения числа хромосом. Если такие изменения пропорциональны (кратны) гаплоидному набору (n), то говорят о полиплоидии или полиплоидизации. Если изменяется число экземпляров только одной или некоторых хромосом набора, то говорят об анеуплоидии. Полиплоидия (а также гаплоидия) – это в строгом смысле показатель степени повторений одного и того же генома в составе комплексов более высокого порядка. При автополиплоидии повторен один и тот же геном, а при аллополиплоидии – два или более разных генома.

Автополиплоидия, или повторение в клетке одного и того же хромосомного набора, свойственна простейшим и часто встречается у растений. Полиплоидные формы обычны среди культурных растений, и наиболее продуктивные формы имеют наибольшие числа хромосом. Это справедливо для пшеницы, овса, картофеля, табака, люцерны и др., а также для многих плодовых деревьев и декоративных растений.

Аллополиплоидия. Как уже отмечалось, многие растения являются природными полиплоидами. Однако чаще всего их полиплоидные ряды не результат автополиплоидизации, а следствие объединения различных геномов посредством гибридизации. Очевидно, при гибридизации двух разных видов даже с одинаковым числом хромосом у полученного амфигаплоида трудно ожидать нормального течения мейоза. Конъюгация хромосом в профазе I мейоза будет нарушена из-за отсутствия гомологов. Если же геномы А и В, объединившиеся в амфигаплоиде, удвоятся (ААВВ), т. е. произойдет полиплоидизация, то фертильность такого амфидиплоида, или аллотетраплоида, будет восстановлена, поскольку теперь хромосомы могут образовывать нормальные пары при конъюгации.

Анеуплоидия, или гетероплоидия, возникает вследствие изменения числа хромосом, некратного гаплоидному набору. В результате нерасхождения хромосом при гаметогенезе могут возникать половые клетки

• лишними хромосомами, и тогда при последующем слиянии с нормальными гаплоидными гаметами они образуют зиготы 2n+1, или трисомики, по определенной хромосоме. Если в гамете оказалось меньше на одну хромосому, то последующее оплодотворение приведет к образованию зиготы

2n – 1, или моносомика, по какой-либо из хромосом. Полисомия и моносомия могут иметь самостоятельное фенотипическое проявление вследствие изменения соотношений доз некоторых генов или нарушения генного баланса. Часто, особенно у животных и человека, лишняя хромосома обусловливает депрессию развития и летальность. Например, лишняя Х-хромосома или 21-я хромосома у человека обусловливает тяжелые аномалии.

На примере гаплоидии особенно наглядна условность отнесения изменения плоидности к разряду мутаций. Во-первых, существуют организмы (как одноклеточные, так и многоклеточные), для которых гаплоидное состояние соматических клеток нормально: грибы, водоросли, а также самцы некоторых насекомых: пчел, муравьев, паразитических ос. Во-вторых, в жизненном цикле большинства эукариот смена гапло- и диплофазы закономерна.

Тем не менее гаплоидию как аномальное состояние генома, при котором гаплоидными оказываются организмы, в норме содержащие двойной набор хромосом, следует рассматривать особо. Гаплоидия на стадии спорофита описана для некоторых цветковых растений: томата, табака, льна, дурмана, некоторых злаков и др.

Непостоянство числа хромосом как особый способ изменений генетического материала сам по себе стал эволюционным приобретением эукариотической клетки в связи с возникновением компартментализации и дифференцировки хромосомного аппарата, появлением митоза и мейоза. Таким образом, само усложнение генетического материала открыло новые пути его изменчивости.

Модификационная изменчивость

Внешние воздействия могут вызывать у особи или группы особей изменения, которые бывают для них вредными, безразличными или полезными, т. е. приспособительными.

1809 г. – Ж.Б. Ламарк, наследование приобретенных признаков.

1859 г. – Ч. Дарвин, разделил изменчивость на определенную и неопределенную.

1865 г. – К. Нэгели, перенос альпийских форм растений на богатую почву и обратно.

В. Иоганнсен, количественный подход к исследованию модификационной изменчивости, наследование массы и размера семян фасоли.

1913 г. – А. Вейсман, выделил соматогенные и бластогенные изменения, т. е. изменения свойств соматических клеток и органов, с одной стороны, и изменения свойств генеративных клеток – с другой. 1592 особи из 22 поколений белых мышей – отрубал хвосты.

Обрезание, пирсинг, уродование ступней, черепа у человека.

Модификации – изменения организма в пределах нормы реакции

Существует множество примеров модификаций, вызываемых различными факторами внешней среды. Один из наиболее впечатляющих примеров – определение пола после оплодотворения у некоторых животных. ex: морской червь Bonellia, крокодилы, переопределение пола, например, у некоторых рыб, подводные и надводные листья некоторых водных растений, окраска шерсти гималайского кролика.

Определенные типы модификаций возникают только у организмов определенного генотипа. Следовательно, способность к модификациям наследуется и характеризует генетически заданную норму реакции. Таким образом, было бы неверно рассматривать ненаследственную изменчивость – модификации – в отрыве от наследственной изменчивости. Возможность модификации определяет генотип при соответствующих условиях внешней среды.

Наиболее известны адаптивные модификации, т. е. ненаследуемые изменения, полезные для организма и способствующие его выживанию при изменившихся условиях. Так, у растений, обитающих в условиях затемнения, увеличиваются листовые пластинки и тем самым усиливается фотосинтез. У пушных зверей при понижении температуры густеет мех. Загар на коже человека представляет собой адаптивное изменение, способствующее большей устойчивости к облучению солнечным светом и т. д.

Адаптивные модификации – это реакция клеток и организма на изменения условий среды, которые неоднократно действовали на организмы в ходе эволюции. Все они – в пределах нормы реакции, заданной генотипом.

Не все модификации, вызываемые условиями внешней среды, адаптивны. При интенсивном действии многих агентов наблюдаются ненаследуемые изменения, случайные (по своему проявлению) но отношению к воздействию. Такие изменения называют морфозами. Очень часто они напоминают фенотипическое проявление известных мутаций. Тогда их называют фенокопиями этих мутаций.

1. конце 30-х – начале 40-х годов XX в. И. А. Рапопорт исследовал действие на дрозофилу многих химических соединений, показав, что, например, соединения ртути вызывают фенокопию Minute (тонкие щетинки); соединения сурьмы – brown (коричневые глаза); соединения серебра – yellow (желтое тело) и т. д. При этом некоторые морфозы при воздействии на определенную стадию развития возникали с высокой частотой (до 100%). Отмечено, что степень выраженности морфоза усиливается при увеличении дозы действующего соединения, что закономерно отличает индукцию морфозов и мутаций. Как известно, степень проявления мутантного гена не зависит от дозы вызвавшего мутацию мутагена.

2. большинстве случаев модификации не стойки и исчезают, как только прекращается действие вызвавшего их агента. Это не относится к морфозам и фенокопиям у многоклеточных, отражающим вмешательство внешних факторов в процессы реализации признака на критической стадии онтогенеза

– в момент детерминации или дифференцировки исследуемого органа. Такие модификации сохраняются в течение всей жизни особи. Необратимость подобных изменений в онтогенезе объясняется необратимостью индивидуального развития.

Известно несколько примеров так называемых длительных модификаций. Наиболее известны эксперименты В. Иоллоса, который впервые показал, что предварительное воздействие на парамеций небольшими дозами ядов повышает устойчивость этих инфузорий к последующим воздействиям тех же агентов. Устойчивость сохранялась лишь

10. течение ряда вегетативных делений парамеций и исчезала после того, как происходила конъюгация, т.е. половое размножение. В данном случае длительная модификация носила адаптивный характер.

Механизмы модификаций

Модификационные изменения традиционно противопоставляют мутациям. В этом противопоставлении заключается глубокий смысл, поскольку мутации – это результат нарушения процессов воспроизведения генов, а модификации – результат изменения действия генов.

Причиной адаптивных модификационных изменений может быть индукция адаптивных ферментов. Например, индуцибельная система репарации у Е. coli или синдром теплового шока.

Закономерная неустойчивость в действии гена, экспрессия которого может спонтанно варьировать, и служит основой проявления модификаций. Например, число фасеток в левом и правом глазах дрозофилы может варьировать. В дальнейшем эти явления получили обобщенное название «шумы индивидуального развития» (developmental noise).

Причиной таких нерегулярных модификаций может быть нарушение экспрессии генетической информации на различных стадиях: от транскрипции до ферментативной реакции, осуществляемой белком – генным продуктом, и далее нарушения морфогенетических процессов.

Другой возможный механизм модификаций – временные ненаследуемые изменения генетического материала, устраняемые затем системами репарации. Большинство первичных (предмутационных) изменений ДНК устраняют системы репарации. Подобные ненаследуемые нарушения структуры генетического материала, если они проявляются в критические периоды индивидуального развития организма, при детерминации клеток могут стать причиной модификаций типа морфозов и других врожденных (но не наследственных) аномалий развития.

Лекция №7

ГЕНЕТИКА ЧЕЛОВЕКА

Генетика человека изучает явления наследственности и изменчивости в популяциях людей, особенности наследования признаков в норме и их изменения под действием условий окружающей среды. Медицинская генетика – важный раздел генетики человека, изучающий роль наследственных факторов в возникновении патологических симптомов и признаков в организме человека. Целью медицинской генетики является разработка методов диагностики, лечения и профилактики наследственной патологии человека.

Задачами генетики человека являются:

• определение полной нуклеотидной последовательности ДНК генома человека, локализации генов и создание их банка;

• ранняя диагностика наследственной патологии путем совершенствования методов пренатальной и экспресс-диагностики;

• широкое внедрение медико-генетического консультирования;

• разработка методов генной терапии наследственных заболеваний на основе генной инженерии;

• выявление генетически опасных факторов внешней среды и разработка методов их нейтрализации.

Человек специфический объект генетического анализа. Изучение генетики человека связано с большими трудностями:

• сложный кариотип – много хромосом и групп сцепления;

• позднее половое созревание и редкая смена поколений (не всегда возможно одновременное обследование представителей трех и более поколений семьи);

• малое количество потомков;

• невозможность экспериментирования;

• невозможность создания одинаковых условий жизни.

Несмотря на перечисленные трудности, генетика человека изучена на сегодня лучше, чем генетика многих других организмов (например, млекопитающих) благодаря потребностям медицины и разнообразным современным методам исследования.

Известно, что наследственные болезни – это часть общей наследственной изменчивости человека, как биологического вида, обеспечивающей его эволюцию и приспособление к меняющимся условиям внешней среды. Кроме того, существует довольно много человеческих популяций, характеризующихся высоким уровнем инбридинга и изоляции. Изучение таких популяций позволяет судить о механизмах распространения мутантных генов и поддержания их частоты на определенном уровне из поколения в поколение.

Основные методы исследования генетики человека.

Клинико-генеалогический метод

Основан на построении родословных и прослеживании в ряду поколений передачи определенного признака.

Этапы генеалогического анализа:

• сбор данных о всех родственниках обследуемого (анамнез);

• построение родословной;

• анализ родословной и выводы.

Сложность сбора анамнеза заключается в том, что пробанд должен хорошо знать, по возможности, большинство своих родственников и состояние их здоровья.

Метод позволяет установить:

• является ли данный признак наследственным;

• тип и характер наследования;

• зиготность лиц родословной;

• пенетрантность гена,

• вероятность рождения ребенка с данной наследственной патологией.

Близнецовый метод используется для выяснения наследственной обусловленности признаков и хорошо демонстрирует взаимоотношения между генотипом и внешней средой. С помощью этого метода удалось оценить значимость генетической предрасположенности ко многим заболеваниям, пенетрантность, экспрессивность и условия проявления тех или иных видов патологии. Близнецовые данные оказываются полезными для количественной оценки степени генетической детерминированности отдельных признаков, в связи с чем, близнецовый метод можно считать одним из важных методов количественной генетики.

Авторство близнецового метода приписывают Ф.Гальтону (1876), который сформулировал концепцию: «природа» или «воспитание» (Nature or Nurture), и изложил основные положения вопроса в книге «Близнецы, как критерий силы наследственности и среды».

Различают моно- и дизиготных близнецов. Монозиготные (однояйцевые) близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки. Монозиготные близнецы имеют совершенно одинаковый генотип и, если они отличаются фенотипически, то это обусловлено воздействием факторов внешней среды.

Дизиготные (двуяйцевые) близнецы развиваются после оплодотворения сперматозоидами нескольких одновременно созревших яйцеклеток. Близнецы будут иметь разный генотип и их фенотипические различия обусловлены как генотипом, так и факторами внешней среды.

Монозиготные близнецы имеют большую степень сходства по признакам, которые определяются в основном генотипом. Например, монозиготные близнецы всегда однополы, у них одинаковые группы крови по разным системам (ABO, Rh, MN и др.), одинаковый цвет глаз, однотипны дерматоглифические показатели на пальцах и ладонях и др. Эти фенотипические признаки и используются в качестве критериев диагностики зиготности близнецов.

Процент сходства группы близнецов по изучаемому признаку называется конкордантностью, а процент различия − дискордантностью. Так как монозиготные близнецы имеют одинаковый генотип, то конкордантность их выше, чем у дизиготных.

Таким образом, близнецовый метод включает следующие этапы:

1. составление выборки,

2. определение типа зиготности,

3. собственно оценка результатов сопоставления пар.

При составлении выборки необходимо соблюдать ряд условий:

• обязательно обследовать обоих членов близнецовой пары (из выборки исключаются пары в случае невозможности обследования одного из близнецов);

• иметь статистически достаточное количество пар близнецов, причем соотношение пар близнецов N_DZ/N_MZ должно совпадать с таковым для изучаемой популяции, так как и процент многоплодия, и указанное соотношение варьируют у разных рас и народов.

3)учитывать соответствие возраста и пола близнецов в сравниваемых выборках.

Для установления типа зиготности можно использовать следующие методы:

• метод оценки количества плодных оболочек (плаценты и хориона),

• метод полисимптомного сходства, предложенный Сименсом и Фершуером в 1924 г. и основанный на сравнении партнеров по внешним морфологическим признакам.

Самым надежным диагностическим тестом является метод оценки частоты встречаемости моногенных полиморфных признаков, впервые примененный Смитом и Пенроузом при анализе зиготности близнецов по группам крови. Для установления типа зиготности этим методом можно использовать анализ эритроцитарных и лейкоцитарных антигенов, белков сыворотки крови, ПДРФ-маркеров, восприятие вкуса фенилтио-карбамида, а также содержание различных веществ в слюне, моче, поте. Сущность этого метода заключается в вычислении вероятности дизиготности и монозиготности пары близнецов одного пола при наличии у них одинаковых маркеров. Вероятность наличия у дизиготных близнецов одинаковых показателей в n-системах, равна произведению вероятностей по каждому тесту (Pd = Pdl x Pd2 x ... х Pdn), а то, что они монозиготны – Рm = (1 – Pd). Результаты расчетов вероятностей встречаемости признаков показали, что сходство дизиготных близнецов по пяти локусам от двух гетерозиготных родителей ожидается лишь в 1,4%.

Для оценки роли наследственности и среды в развитии того или иного признака используют формулу Хольцингера:

Н= (КМБ% − КДБ%)/(100% − КДБ%)

где Н − доля наследственности, КМБ% − конкордантность монозиготных близнецов, КДБ% − конкордантность дизиготных близнецов.

Если Н > 0,7 (70%), то решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам, если показатель Н находится в интервале 0,3−0,7 (30−70%), то на проявление признака оказывают влияние как наследственные, так и внешнесредовые факторы с тем или иным преимуществом. Основная роль факторов внешней среды в проявлении признака предполагается, если Н < 0,3 (30%).

Близнецовые исследования, (определение коэффициента наследуемости и конкордантности пар) сыграли значительную роль при изучении генетики поведения, многих инфекционных и, так называемых, мультифакториальных заболеваний.

Довольно часто в генетике человека используется не классический близнецовый метод, а его модификации, например, для изучения возможностей улучшения определенных характеристик интеллекта путем психологической тренировки − метод контроля по партнеру, для исследования сахарного диабета − метод близнецовых семей. Наследование психологических особенностей личности и интеллекта удобно анализировать на разлученных близнецах, которые были разделены в младенческом или раннем возрасте и воспитывались раздельно, не имея влияния общей среды и специфического взаимодействия между собой.

Однако не всегда возможно получить достоверные данные при изучении признаков близнецовым методов. Это связано с систематическими различиями между близнецами и не близнецами по ряду признаков (по массе, частоте врожденных аномалий, индексу IQ) и психологическими и социальными особенностями развития близнецов в постнатальный период. Эти факторы и являются ограничениями использования данного метода.

Популяционно-статистические методы – методы, используемые для установления частот генов и генотипов в популяции, демонстрирующие характер их изменения под влиянием окружающей среды и различных факторов популяционной динамики.

С помощью этих методов можно:

1. определить частоты генов, степень гетерозиготности и полиморфизма,

2. установить, как меняются частоты генов под действием отбора,

3. выявить влияние факторов популяционной динамики на частоты тех или иных генотипов и фенотипов,

4. проанализировать влияние факторов внешней среды на экспрессию генов,

5. определить степень межпопуляционного генетического разнообразия и вычислить генетическое расстояние между популяциями.

Популяционно-генетические исследования включают следующие этапы:

1. подбор популяции с учетом демографических характеристик,

2. сбор материала,

3. выбор метода статистического анализа.

Генетическое изучение популяций человека предполагает знание их демографических характеристик (размер популяций, рождаемость, смертность, возрастная структура, национальный состав), а также географических и климатических условий жизни, религиозных убеждений и т.д. Это связано с некоторыми особенностями популяций человека, которые могут быть панмиксными (случайные браки) и инбредными (высокая частота кровнородственных браков). В популяциях человека формирование субпопуляций связано с такими формами изоляции, которые свойственны только человеку, например расовая, социальная (социальное положение, экономические, этнические, языковые, административные), конфессиональная и идеологическая. Все это необходимо учитывать при интерпретации полученных при популяционно-генетических исследованиях результатов. Во избежание получения недостоверных результатов, выбираемая для изучения популяция также не должна быть очень большой или очень малой. Чем больше по размеру популяция (но не до бесконечности), тем выше уровень ее разнообразия и тем сложнее ее генетическая структура, а также ближе соответствие между реально наблюдаемыми и ожидаемыми генными частотами. Так для генетических исследований оптимальным считается размер популяции с численностью от 0,5–5,0 млн. человек.

Наследственные заболевания распределены по различным регионам земного шара, среди разных рас и народностей неравномерно. Например, гомозиготы по гену HbS в Беларуси практически не встречаются, а в странах Западной Африки частота их варьирует от 25% в Камеруне до 40% в Танзании. Изучение распространения генов среди населения различных географических зон (геногеография) дает возможность установить центры происхождения различных этнических групп и их миграции, определить степень риска появления наследственных болезней у отдельных индивидуумов, правильно организовать профилактические мероприятия.

Если известна частота заболевания в популяции, и при допущении, что эта популяция находится в генетическом равновесии по данному признаку, для расчета частот генотипов и фенотипов наиболее широко применяется формула Харди–Вайнберга. Для диаллельной системы она имеет вид р² + 2pq

• q² = (р + q)² = 1, для трехаллельной — (а + b + с)² = 1. Например, частота ФКУ в популяции составляет 1:10000, т.е. q² = 0,0001, значит q = 0,01. По закону Харди-Вайнберга р + q = 1, отсюда р = 1 - q = 1-0,01 = 0,99, a 2pq = 2

• 0,99 х 0,01 = 0,0198. Таким образом, частота гетерозигот по гену ФКУ в изучаемой популяции составляет приблизительно 2%.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании кариотипа. Этапы метода:

1. культивирование клеток человека (чаще лимфоцитов) на ис-кусственных питательных средах;

2. стимуляция митозов фитогемагглютинином (ФГА);

3. добавление колхицина (разрушает нити веретена деления) для остановки митоза на стадии метафазы;

4. обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие чего хромосомы рассыпаются и лежат свободно;

5. окрашивание хромосом;

6. изучение под микроскопом и фотографирование;

7. вырезание отдельных хромосом и построение идиограммы.

В 70-е годы были разработаны методы дифференциального окрашивания хромосом человека, которые показали, что каждая пара хромосом имеет специфический характер чередования неокрашенных, светло- и темно-окрашенных дисков (Парижская классификация).

Метод позволяет выявлять геномные (например, болезнь Дауна) и хромосомные (например, синдром кошачьего крика) мутации. Хромосомные аберрации обозначают номером хромосомы, короткого или длинного плеча и избытком (+) или нехваткой (–) генетического материала. Например, синдром кошачьего крика обозначают: 5р–.

Молекулярно-цитогенетический метод. В ряде случаев использование традиционного цитогенетического метода не позволяет идентифицировать все имеющиеся хромосомные перестройки, особенно если в них вовлечены более двух хромосом или они захватывают очень малый по размеру участок. Для этих целей в последние годы разработаны новые высокоинформативные молекулярно-цитогенетические методы, главный из которых флуоресцентная гибридизация in situ, или так называемый FISH- метод (от англ. fluorescent in situ hybridization). С помощью этого метода можно проводить гибридизацию метафазных или интерфазных хромосом с различными ДНК-зондами, меченными флуоресцирующими веществами.

Для успешного осуществления этих методов созданы специальные библиотеки хромосомоспецифичных участков ДНК. В последние годы при проведении FISH-анализа все чаще используют ДНК-зонды, меченные различными цветами. Применение разноцветных зондов позволяет более быстро и эффективно провести анализ количественных и структурных перестроек хромосом, особенно, в случае пренатальной экспресс-диагностики.

Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем (либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой данным ферментом). Они позволяют выявлять генные мутации – причины болезней обмена веществ (например, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия). С помощью биохимических нагрузочных тестов можно выявлять гетерозиготных носителей патологических генов, например, фенилкетонурии. Исследуемому человеку вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через равные промежутки времени определяют его концентрацию в крови. Если человек гомозиготен по доминантному гену (АА), то концентрация фенилаланина в крови довольно быстро возвращается к контрольному уровню (определяется до введения фенилаланина), а если он гетерозиготен (Аа), то снижение концентрации фенилаланина идет вдвое медленнее.

Аналогично проводятся тесты, выявляющие предрасположенность к сахарному диабету, гипертонии и др. болезням.

Методы рекомбинантной ДНК. Эти методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и сегменты генов и устанавливать в них последовательность нуклеотидов.

Метод клонирования ДНК позволяет изолировать отдельные гены или их части, транскрибировать (создавать их копии) и транслировать изолированные гены. Это стало возможным благодаря открытию ферментов-рестриктаз. Эти ферменты опознают специфическую олигонуклеотидную последовательность в двухнитевой ДНК и разрезают ее в данном сайте (месте). Разные рестриктазы распознают различные последовательности нуклеотидов и разрезают ДНК в разных сайтах.

Гибридизация нуклеиновых кислот. При этом методе линейные отрезки двухцепочечной ДНК подвергают тепловой обработке и получают одноцепочечные фрагменты (денатурирование). Денатурированную ДНК инкубируют при таких условиях (t = 37° С), когда происходит гибридизация, т.е. взаимное распознавание двух комплементарных нитей посредством спаривания азотистых оснований. Часто для идентификации порядка нуклеотидов используют в качестве «зонда» одну радиоактивную нить ДНК. Можно идентифицировать как полностью, так и частично гомологичные последовательности. Специфичность гибридизации нуклеиновых кислот позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч. Различные модификации этого метода позволяют в клинике анализировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.

Для широкого применения в практическом здравоохранении методов рекомбинантной ДНК необходимо создание библиотек радиоактивных зондов всех последовательностей ДНК генома человека, что теперь успешно выполняют.

Методы генетики соматических клеток дают возможность изучать многие вопросы генетики человека в эксперименте. Для культивирования чаще используют клетки соединительной ткани (фибробласты) и лимфоциты крови. На искусственных питательных средах их можно клонировать, т.е. получать потомков одной клетки. Все они будут иметь одинаковый генотип (как монозиготные близнецы) и, следовательно, на клеточном уровне можно изучать роль генотипа и среды в проявлении признаков.

Можно проводить селекцию клеток – отбор клеток с заранее заданными свойствами. Для этого используют селективные питательные среды. Например, если в питательную среду добавить не лактозу, а другие сахара, то из большого числа клеток найдется несколько, которые смогут существовать без лактозы, и в дальнейшем можно получить клон таких клеток.

Наибольший интерес для генетики человека представляет метод гибридизации соматических клеток. В 1960 г. французский ученый Ж. Барский, выращивая в культуре клетки две линии мышей, обнаружил, что некоторые из них по своим морфологическим и биохимическим свойствам оказались промежуточными между исходными родительскими клетками. Это были гибридные клетки.

Такое спонтанное слияние соматических клеток в культуре ткани происходит довольно редко. В дальнейшем было установлено, что при введении в культуру клеток РНК-содержащего вируса парагриппа Сендай, инактивированного при облучении ультрафиолетом, частота гибридизации клеток значительно повышается, и в смешанной культуре разных типов клеток образуются гетерокарионы − клетки, содержащие два ядра разных клеток в одной цитоплазме. Часть таких клеток способна размножаться митозом. После митоза из двухядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион − настоящую гибридную клетку, содержащую хромосомы обеих исходных клеток.

Гибридизация возможна не только между клетками организмов разных видов, но и типов: человек-мышь, человек-комар и др. Синкарионы обычно удается получать при гибридизации клеток разных видов, относящихся к одному классу. В таких синкарионах происходит объединение геномов двух видов. Например, гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом: 23 − от человека и 20 − от мыши. В дальнейшем происходит постепенное удаление хромосом того организма, клетки которого имеют более медленный темп размножения. У гибридных клеток человек-мышь удаляются хромосомы человека. В гибридных клетках функционируют хромосомы как человека, так и мыши, гены которых детерминируют синтез соответствующих белков.

Морфологически можно отличить каждую из хромосом (дифференциальное окрашивание).

Если в гибридной клетке отсутствует какая-либо хромосома и не происходит синтез каких-то белков, то можно предположить, что гены, детерминирующие синтез этих белков, локализованы в данной хромосоме. Таким образом, метод позволяет устанавливать группы сцепления у человека, а используя нехватки и транслокации выяснять и последовательность расположения генов, т.е. строить генетические карты хромосом человека.

Биологическое моделирование определенных наследственных аномалий человека можно проводить на мутантных линиях животных, имеющих сходные нарушения. Например, у собак встречается гемофилия, обусловленная рецессивным сцепленным с Х-хромосомой (с полом) геном, несращение губы и неба у мышей сходно с аналогичными аномалиями человека, у хомяков и крыс встречаются сахарный диабет, ахондроплазия, мышечная дистрофия и др. Хотя мутантные линии животных не дают точную картину наследственных болезней человека, даже частичное воспроизведение их фрагментов в ряде случаев позволяет изучить механизмы первичного отклонения от нормы. Закон гомологичных рядов Н. И. Вавилова (виды и роды генетически близкие обладают сходными рядами наследственной изменчивости) позволяет с определенными ограничениями экстраполировать экспериментальные данные на человека.

Математическое моделирование – это метод создания и изучения математических моделей. Его применяют для расчетов частот генов в популяциях при различных воздействиях и изменениях окружающей среды. Математические методы широко применяются в тех случаях, когда невозможно использование экспериментальных методов (например, анализ большого количества сцепленных генов у человека).

Лекция №8

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СЕЛЕКЦИИ

Для решения продовольственной проблемы с учетом роста населения земного шара необходимы научные методы ведения сельского хозяйства, ключевая роль в этом принадлежит селекции растений и животных. В течение послевоенного периода во многих странах развилась также селекция микроорганизмов, обеспечивающая потребности микробиологической промышленности и сельского хозяйства. В последние годы селекция полезных человеку организмов обогатилась достижениями генной и клеточной инженерии, биотехнологии.

Наконец, при современных промышленных методах освоения биологических ресурсов, например в лесной промышленности, рыболовстве, также требуются знания селекционных закономерностей как для рационального использования, так и для возобновления природных источников.

Селекция - наука, изучающая генетические основы методов создания и улучшения пород животных, сортов растений и штаммов микроорганизмов. В понимании Н. И. Вавилова селекция как наука объединяет подходы, характерные для эволюционной биологии и генетики. Селекция разрабатывает конкретные приемы и рекомендации, которые находят практическое применение в частной селекции отдельных видов. Точка зрения Н. И. Вавилова актуальна и в наши дни.

Цели селекции обусловлены уровнем агротехники и зоотехнии, уровнем

индустриализации растениеводства и животноводства. Основными направлениями селекции являются: 1) высокая урожайность сортов растений, плодовитость и продуктивность пород животных; 2) качество продукции (например, вкус, внешний вид, лежкость плодов и овощей, химический состав зерна – содержание белка, клейковины, незаменимых аминокислот и т. д.); 3) физиологические свойства (скороспелость, засухоустойчивость, устойчивость к болезням, вредителям и неблагоприятным климатическим условиям); 4) интенсивный путь развития (у растений – отзывчивость на удобрения, полив, а у животных – «оплата» корма и т. п.).

Селекция должна учитывать и потребности рынка сбыта продукции. Так, мексиканские сорта пшеницы проникли в Индию и Пакистан только потому, что у них окраска зерна изменена на белую, а местное население привыкло печь хлебные лепешки из белого зерна. Для удовлетворения конкретных отраслей промышленности производство сельскохозяйственной продукции должно быть ориентировано на специализированную селекцию. Например, для выпечки высококачественного хлеба необходимы стекловидные (сильные) сорта мягкой пшеницы, макароны вырабатывают из твердой пшеницы, для изготовления сухого печенья высоких сортов нужны хорошие мучнистые (слабые) сорта мягкой пшеницы и т. д. Ярким примером селекции с учетом потребностей рынка служит пушное звероводство, в частности норководство, при котором генотип товарных животных ориентирован на моду в отношении окраски и оттенков меха.

Поскольку свойства живых организмов определяются их генотипом и подвержены наследственной и модификационной изменчивости, развитие селекции должно быть основано на законах генетики как науки о наследственности и изменчивости.

Породы и сорта

Породы животных, сорта растений, штаммы микроорганизмов представляют собой совокупности организмов, характеризующиеся определенной генетической структурой и, следовательно, нормой реакции, которые определяют их специализацию и продуктивность. В то же время сорт (порода, штамм) как биологическое средство производства отражает уровень развития техники и потребности общества.

• развитых странах современная селекция достигла больших успехов, что затрудняет дальнейшее улучшение существующих пород и сортов. Каждый новый шаг дается все с большим трудом. Поэтому немалое значение приобретает планирование будущей формы — создание модели породы или сорта.

При создании модели будущего сорта или породы необходимо учитывать их назначение и те компоненты структуры и физиологических показателей, из которых будет складываться продуктивность.

Процесс селекции должен опираться на знание генетических закономерностей наследования признаков, их изменчивости, на знание популяционной генетики, различных способов скрещивания и методов отбора.

Количественные признаки

Комбинативная изменчивость способна обеспечить огромное разнообразие вариантов признаков. Например, гетерозигота по 16 генам при самоопылении образует более 43 млн. генотипов. При изучении наследования так называемых качественных признаков такая степень гетерозиготности исключительно редка. В то же время при изучении генетического контроля признаков продуктивности растений и животных — урожайности, скорости роста — расщепление в потомстве гибридов редко происходит менее чем по 16 генам.

Первая важная особенность элементов продуктивности — их непрерывное варьирование, характерное для всех количественных, т. е. мерных, признаков, к которым относятся масса, рост животных, молочность, яйценоскость и др. То же самое справедливо и для мерных признаков растений.

Вторая особенность этих признаков — их зависимость от большого числа взаимодействующих генов. При большом числе генов, действующих на один и тот же признак, ошибки измерения часто сопоставимы с различиями между классами, и дискретное наследование отдельных генов невозможно вычленить.

Третья особенность количественных признаков заключается в том, что они также подвержены влиянию модификационной изменчивости, результат которой непрерывен, т. е. он еще больше «смазывает» различия между классами. Все вместе это приводит к тому, что изменчивость по количественным признакам оказывается непрерывной.

Таким образом, наследование и изменчивость по количественным признакам нельзя изучать теми же методами, что и по качественным признакам. В последнем случае используют термины сильный и слабый ген (гены) в зависимости от их влияния на количественный признак. Между сильными и слабыми генами можно наблюдать промежуточные варианты проявлений. Кроме того, вследствие плейотропии один и тот же ген можно рассматривать как сильный по отношению к одним признакам и как слабый по отношению к другим. Изменчивость вследствие расщепления по многим генам называют полигенной, а обусловливающие ее слабые гены — полигенами.

Собственно первое исследование полигенной изменчивости было сделано Г. Нильсоном-Эле, открывшим полимерное действие генов, или явление кумулятивной полимерии.

Результатом действия факторов окружающей среды будет изменчивость количественных признаков, которую обозначают общим термином паратипическая. Учитывая, что паратипическая изменчивость в значительной степени обусловлена модификациями, необходимо знать, в какой мере их проявление зависит от генотипа. Для этого вычисляют коэффициент наследуемости признака, который показывает, какова доля генотипической изменчивости в наблюдаемых вариациях.

Коэффициент наследуемости представляет собой конкретную характеристику признака в данной группе особей. Его величина варьирует не только для разных признаков, но и для разных популяций в зависимости от уровня их гетерозиготности. Величина нарастает по мере увеличения гетерогенности популяции. Чем более гомогенна популяция, тем ниже коэффициент наследуемости и, следовательно, тем менее перспективен в ней отбор по изучаемому признаку. Коэффициент наследуемости повышается при создании более благоприятных условий для проявления признака.

Способы отбора

Как было показано, в популяции, не испытывающей влияния отбора, возможны лишь очень медленные изменения за счет мутационного процесса или случайные флуктуации частот аллелей вследствие генетико-автоматических процессов. Значение искусственного отбора по достоинству оценил Ч. Дарвин. Собственно успехи селекционеров, владевших приемами отбора, и натолкнули Ч. Дарвина на идею естественного отбора. Сходство между эволюционным процессом и селекцией дало Н. И. Вавилову основание назвать селекцию эволюцией, направляемой человеком.

Наряду со сходством естественного и искусственного отбора между ними есть и существенные различия.

Искусственный отбор проводят при определенных условиях, избранных селекционером. Например, отбор по устойчивости растений к патогенным микроорганизмам может вестись в теплице при определенной температуре, влажности, освещенности. Следует подбирать такие условия, в которых селектируемый признак выражается наиболее полно. Известен пример отбора крыс по устойчивости к бактериям, вызывающим кариес зубов. Когда искусственный отбор вели среди животных, получавших корма тонкого помола, наблюдали незначительный эффект. Когда же эксперимент повторили при кормлении крыс пищей грубого помола, устойчивость к кариесу возросла в 7 раз через 11 поколений, поскольку пища грубого помола — лучший провокационный фон для проявления признака, по которому вели отбор в положительную сторону. В этих условиях отбор наиболее восприимчивых животных в каждом поколении также привел к ощутимому снижению устойчивости крыс к кариесу (отбор в отрицательную сторону).

Этот пример одновременно иллюстрирует еще одно отличие искусственного отбора от естественного. Искусственный отбор экспериментатор ведет совсем не обязательно в сторону адаптивного проявления признака. Так, в модельных экспериментах с дрозофилой Л. 3. Кайданов отселектировал линию НА с явно инадаптивными свойствами — пониженной половой активностью самцов. В то же время при естественном отборе преимущество в оставлении потомства почти всегда имеют более приспособленные генотипы. Исключение составляют некоторые мутантные аллели, обусловливающие в гомозиготе инадаптивные признаки, но дающие преимущество их гетерозиготным носителям, как было показано на примере серповидноклеточной анемии у человека.

Наконец, естественный отбор идет в условиях преимущественно случайных скрещиваний, обеспечивающих то или иное приближение к панмиксии, в то время как искусственный отбор проводят при строго контролируемых скрещиваниях небольшого числа особей.

Необходимо помнить, что время селекционера ограничено, ограничена и выборка (популяция), с которой он работает. Этим искусственный отбор также отличается от естественного. Поэтому искусственный отбор нельзя вести сразу по всем признакам: приходится отбирать, например, животных, лучших по определенным признакам, но средних по другим или всем остальным.

В селекции принято различать два основных типа отбора: массовый и индивидуальный.

Массовый отбор проводится по внешним, фенотипическим характеристикам в направлении, избранном селекционером. Генетический эффект отбора зависит от того, насколько точно селекционер может различать нужные генотипы. Наследуемость количественных признаков часто низка, поэтому ориентация только на фенотип особи ненадежна. Так, отбор лучших несушек без учета их родословных редко приводит к улучшению яйценоскости. На этот признак большое влияние оказывает среда и его коэффициент наследования низок. Например дочери лучших и худших матерей несли в среднем примерно одинаковое количество яиц в месяц. В то же время дочери матерей, несших более крупные яйца, также несли более крупные яйца, а дочери матерей, несших мелкие яйца, тоже наследовали этот признак. Объяснение заключается в том, что коэффициент наследуемости массы яиц выше, чем для яйценоскости. Следовательно, массовый отбор может дать результаты только при достаточно высоком коэффициенте наследуемости.

Массовый отбор эффективен в отношении признаков, контролируемых одним или немногими генами, т. е. для качественных признаков. Количественный анализ результатов селекции «моногенных» признаков проводят на основе закономерностей популяционной генетики.

Массовый отбор редко бывает успешным по полигенным признакам с низким коэффициентом наследования. В этом случае необходимо применять индивидуальный отбор.

Индивидуальный отбор основан на оценке генотипа растения или животного, используемого в селекционном процессе. Для этого необходимо получить потомство отбираемого организма и оценить его показатели. При индивидуальном отборе популяцию делят на семьи или изучают потомство от самоопыление отдельных растений (инбридинг или инцухт), где это позволяет система несовместимости. У животных ведут инбридинг посредством близкородственных скрещиваний для повышения уровня гомозиготности. На последующих этапах отбора используют тех особей, которые дали наибольшее число потомков с высокими показателями. Учитываются также данные родословных и сведения о продуктивности сибсов (братьев и сестер) и их потомков.

Одним из вариантов оценки потенций селектируемых организмов является сибселекция, которая заключается в закладке индивидуальных семей или проведении индивидуальных скрещиваний и разделении полученного потомства на две части в каждой семье. Половину каждого потомства проверяют по выбранному показателю и таким образом выявляют наилучшую семью. Далее оставшуюся часть потомства лучшей семьи размножают, получают следующее поколение и всю процедуру повторяют вновь. Такой подход применим к многоплодным животным, например к насекомым, а также к растениям. Он не применим ко многим сельскохозяйственным животным. Неудобство, которое сопряжено с проверкой производителей по потомству, — это длительность времени, необходимого для получения результата, и его неизбежная потеря для использования, наконец, оцененного по достоинству производителя. В настоящее время эта проблема в принципе решена благодаря разработке методов искусственного осеменения и практически неограниченно долгого хранения спермы производителей.

Индивидуальный отбор затруднен при работе с перекрестно опыляемыми растениями. В этом случае невозможна закладка индивидуальных самоопыляющихся линий. Однако знание генетического контроля несовместимости и получение самосовместимых мутантов позволяет преодолеть эту трудность. Такой метод предложен В. Г. Смирновым для создания исходного селекционного материала у ржи. Различные формы ржи скрещивают с одной и той же самосовместимой формой и в полученном потомстве проводится самоопыление, закладываются линии, которые далее могут быть оценены по показателям продуктивности и другим хозяйственно важным признакам. Данный прием позволяет резко повысить гомозиготность растений и перейти к методам индивидуального отбора в селекции видов со строго перекрестным опылением.

Селекцию по количественным признакам можно облегчить, если в виде косвенного показателя продуктивности использовать какие-либо качественные маркеры — сигнальные, или сигналы, как их называл А. С. Серебровский. В последнее время большие надежды возлагают на изозимные спектры, которые могут быть применены в качестве сигналей. Этот подход успешен, если наследование определенных изозимов коррелирует с наследованием признаков продуктивности благодаря совпадению условий их максимальной экспрессии либо благодаря сцеплению между теми и другими генами. Так, было показано, что четыре катодные фракции эстеразы коррелируют с размерами и массой зерновок риса. При этом две из четырех фракций лучше проявляются у тонкозерных сортов, а две другие — у крупнозерных. Средний урожай зерна у гибридов кукурузы коррелирует с разнообразием в исходном материале зоферментов эстеразы, кислой фосфатазы, пероксидазы и алкоголъдегидрогеназы.

Полиморфизм по белкам используют и в животноводстве для контроля родословных. Породы животных различают по частоте встречаемости аллелей многих полиморфных локусов, кодирующих ферменты. Однако вопрос о возможности отбора более продуктивных животных по изозимным спектрам белков остается спорным.

Типы скрещиваний в селекции

Отбор в селекции сочетается с различными способами разведения растений и животных. Отбор достаточно эффективен только в сочетании с определенными типами скрещиваний. Все разнообразие типов скрещиваний сводится к инбридингу и аутбридингу. Инбридинг — это близкородственное, а аутбридинг —неродственное скрещивание. Разновидность аутбридинга — кроссбридинг, или межпородное скрещивание.

Инбридинг применяют для разложения популяции на гомозиготные линии, что легче всего достигается у растений-самоопылителей, как это показал В. Иоганнсен. Для организмов с перекрестным размножением необходимы близкородственные скрещивания: брат — сестра, отец — дочь, мать — сын, двоюродные братья — сестры и т. д. При моногенном наследовании признака в популяции очень скоро становится гомозиготным большинство особей.

Гомозиготизация по генам, контролирующим изучаемый признак, происходит тем быстрее, чем более близкородственные скрещивания используют при инбридинге. Если признак контролируют несколько генов, то гомозиготизация идет медленнее (если не применяют самооплодотворение). Поскольку в большинстве случаев рецессивные аллели, находящиеся в гетерозиготном состоянии в популяции, оказывают отрицательное влияние на организм, следствием инбридинга будет постепенное вырождение, или инбредная депрессия, обусловленная гомозиготизацией рецессивных аллелей. Одновременно инбридинг приводит к выравниванию линий, делает их гомогенными по большинству признаков.

Это не означает, что путем инбридинга можно получить абсолютно гомозиготные линии. Они всегда будут гетерозиготны по половым хромосомам. Разрушает гомозиготность и мутационный процесс.

Для характеристики степени инбридинга служит коэффициент инбридинга (Р) к противоположному эффекту приводит аутбридинг или неродственное скрещивание. Аутбридинг повышает уровень гетерозиготности поколения и популяции. И F1 при скрещивании выровненных инбредных линий гибридные потомки обычно также представляют выровненный материал, что соответствует закону Г. Менделя о единообразии гибридов F1. Последующее расщепление создает гетерогенность.

Гетерозис

Гетерозис — гибридная мощность, проявляющаяся в превосходстве гибрида над обоими родительскими формами. Это явление было описано еще И. Г. Кельрейтером, одним из первых предшественников Г. Менделя. Свои результаты по изучению гибридов между «Виргинским» и «Перувианским» табаками он опубликовал в «Трудах Вольного экономического общества» Санкт-Петербурга (1772).

Гетерозис широко используется в селекции растений и животных, но механизм гибридной мощности до сих пор до конца не ясен.

Депрессия, связанная с инбридингом, — явление, противоположное гетерозису. Существование первого обычно служит гарантией второго и, если инбредную депрессию связывают с гомозиготизацией линий, то гетерозис — с резким повышением гетерозиготности. Еще И. Г.

Кельрейтер отмечал, что мощность гибридов связана со степенью генетического различия их родителей. Кроме того, он отметил, что гибридная сила имеет особое значение в естественных, природных условиях. Оба наблюдения в дальнейшем получили многочисленные подтверждения. Значение перекрестного оплодотворения подробно обсуждал Ч. Дарвин (1876) в своем труде «Действие перекрестного опыления и самоопыления в растительном мире», где отметил, что перекрестное оплодотворение обычно полезно, а самооплодотворение вредно. При этом Ч. Дарвин не оставил без внимания и самоопыляющиеся растения, благополучно существующие в условиях инбридинга.

Все это подчеркивает сложность проблемы гетерозиса. Характерная его черта — постепенное затухание в ряду поколений. По данным В. Шелла, урожайность зерна гетерозисных гибридов кукурузы в F2 в среднем снижается на 35 %, а в F3 — на 50 % по сравнению с урожайностью в F1. Многочис-ленные попытки «закрепления» гетерозиса пока не привели к существенным результатам, за исключением тех случаев, когда материал можно размножать вегетативно. Пути закрепления гетерозиса видят в переводе гибридов к размножению посредством апомиксиса или полиплоидизации с использованием колхицина или некоторых мутантов с нарушениями мейоза. Полиплоидизация не закрепляет гетерозис, а замедляет снижение его эффекта в последующих поколениях благодаря нарушению принципа чистоты гамет.

Гетерозис может касаться отнюдь не всех признаков растения или животного. А. Густафссон предложил следующую классификацию типов гетерозиса у растений:

• репродуктивный гетерозис, который выражается в лучшем развитии органов размножения, приводит к повышению урожайности плодов и семян;

• соматический гетерозис, приводящий к мощному развитию вегетативной массы;

• приспособительный, или адаптивный, гетерозис, который выражается в общем повышении жизнеспособности. Выделение этого типа гетерозиса связано с тем, что более мощное развитие у гибридов каких-либо отдельных признаков еще не означает повышения адаптивной ценности организма.

Особенно наглядно это показано для культурных растений, у которых развитие хозяйственно ценных признаков обычно не совпадает с биологической пользой. Крупноколосые и крупнозерные сорта злаков обычно менее морозостойки и менее засухоустойчивы, увеличение длины стебля ведет к полеганию растений и т. д.

Проявление гетерозиса зависит от направления скрещивания и может наблюдаться только в одном из реципрокных скрещиваний. Большое значение имеют также условия выращивания гибридов F1. Признаки высокой продуктивности могут в полной мере проявиться только при благоприятных условиях.

Наилучшие результаты дает гетерозис при скрещивании определенных линий, поэтому необходимо предварительно проверять их на комбинационную способность, т. е. на способность образовывать продуктивные гибриды.

Теории гетерозиса подразделяют на следующие основные группы. Теория доминирования объясняет гетерозис подбором у гибрида благоприятных доминантных аллелей разных генов, утраченных при инбридинге.

Теория сверхдоминирования связывает гибридную мощность с преимуществом гетерозиготного состояния (АА<Аа>аа). При этом эффект сверхдоминирования в гетерозиготе может наблюдаться даже в том случае, когда рецессивная аллель в гомозиготе летальна или приводит к снижению жизнеспособности.

Значение аллельных взаимодействий в проявлении гибридной мощности подтверждают примеры так называемого моногенного гетерозиса. Так, С. Даскалов получил гетерозисные гибриды томата, преимущество которых по продуктивности было связано с гетерозиготностью по одной хлорофилльной мутации (летальной в гомозиготе!).

Синтез представлений об аллельных и неаллельных взаимодействиях, обеспечивающих гетерозис, предложил В. А. Струнников в своей теории компенсаторных комплексов. Этот термин обозначает комплекс генов и их аллелей, который подбирается при получении инбредных линий. Компенсаторный комплекс генов нивелирует отрицательные эффекты высокого уровня гомозиготности, а при гибридизации дает тот самый эффект в выражении признаков, который и обусловливает гетерозис.

Полиплоидия и отдаленная гибридизация

Эффект автополиплоидии, заключающийся в увеличении размеров клеток всего растения вследствие умножения числа наборов хромосом, широко применяют при создании новых сортов растений. При этом учитывают, что лучшие результаты получаются у видов с меньшим, нежели у видов с большим исходным числом хромосом, у перекрестноопыляющихся, а не у самоопылителей и, наконец, у растений, используемых для получения массы вегетативных органов в сравнении с растениями, выращиваемыми для получения семян.

При получении полиплоидных форм нельзя надеяться на то, что они сразу же окажутся готовыми сортами, даже если они происходят от перспективных диплоидных сортов. Необходим этап селекции, в ходе которой может быть повышена фертильность, отобраны формы, образующие с большей частотой тетраваленты в мейозе, повышена устойчивость растений к неблагоприятным условиям. Большое значение при создании сорта имеет его оптимальная популяционная структура, обеспечивающая адаптивную ценность.

У ряда растений триплоиды по вегетативной массе оказываются урожайнее диплоидов и тетраплоидов. Это в частности, относится к сахарной свекле, триплоидные гибриды которой широко применяются в производстве. Поскольку триплоиды стерильны, необходимо каждый раз получать гибридные семена от скрещивания диплоидной и тетраплоидной форм. Успешному применению этой процедуры способствовало открытие мужской стерильности у свеклы. Стерильность триплоидных гибридов может приобретать и положительное значение, например для арбуза, винограда, образующих бессемянные плоды.

Ценные результаты дает использование в селекции явления аллополиплоидии. Основой этого подхода служит метод отдаленной гибридизации. Он широко применяется при получении новых форм плодовых растений, которые можно размножить вегетативно. Методы восстановления фертильности у отдаленных гибридов и способы получения форм, дополненных или замещенных по отдельным хромосомам, позволяют объединять и пере-комбинировать ценные качества растений разных видов.

Использование мутационного процесса в селекции

Спонтанные мутанты находят применение преимущественно в селекции растений. Так, на основе мутанта желтого люпина, лишенного алкалоидов, получен ряд сортов сладкого люпина, которые выращивают на корм скоту. Люпин, содержащий алкалоиды, для этой цели непригоден, так как животные его не едят. Большое число мутантов известно у плодовых культур. Эти мутанты используют непосредственно как новые сорта или в гибридизации с другими формами. Благодаря возможности вегетативного размножения плодовых у них оказывается перспективной многоступенчатая селекция мутантов. Особенно часто используют мутантов в декоративном цветоводстве. С открытием мутагенного эффекта радиации и химических веществ развернулись работы по получению индуцированных мутантов.

Индуцированные рентгеновскими лучами мутанты ячменя получены А. Густафссоном. Среди них отобраны формы с повышенной урожайностью зерна, а также ставший теперь знаменитым мутант с укороченным стеблем. Аналогичные мутанты были выделены затем у многих злаков. Они отличаются устойчивостью к полеганию и дают большие преимущества при машинной уборке. Кроме того, короткая и твердая соломина дает возможность вести дальнейшую селекцию на увеличение размера колоса и массы семян без опасения, что повышение семенной продуктивности приведет к полеганию растений.

С помощью мутагенов получают и мутации мужской стерильности, используемые далее в селекционных программах, при получении гетерозисных гибридов сахарной свеклы, риса и других культур. Под руководством И. А. Рапопорта в СССР широко развернуты работы по применению химического мутагенеза в селекции растений и животных.

• помощью индуцированного мутагенеза выведена линия шелкопряда, у которой обе половые хромосомы маркированы рецессивными летальными мутациями. При скрещивании таких дигетерозиготных самцов с любыми нормальными самками все женское потомство погибает, поскольку при структуре 2№ либо одна, либо другая леталь оказывается в гемизиготе. Таким образом выкармливают почти исключительно самцов. Лишь в редких случаях появляются самки с частотой 1:500, 1:1000 вследствие кроссинговера в 2-хромосоме у исходного самца. Система скрещиваний, использованная при выведении линии и получении чисто мужского потомства, показана на рис. Особенно успешно применяют индуцированный мутагенез в селекции микроорганизмов. В нашей стране целый ряд продуцентов антибиотиков получен под руководством С. И. Алиханяна путем обработки актиномицетов мутагенами физической и химической природы, а также при помощи комбинированных воздействий.

Рассмотренные в этой главе генетические методы и закономерности показывают, что селекция представляет собой область наиболее полного практического воплощения результатов, получаемых генетикой. Все традиционные разделы генетики — гибридизация, мутационный процесс, хромосомные перестройки и полиплоидия, генетика популяции и т. д. — находят применение в селекции. Развивающиеся в последнее время методы генной и клеточной инженерии, биотехнология обещают в ближайшее время обогатить генетические основы селекции новыми подходами, главное содер-жание которых — сокращение сроков получения исходного материала для селекции и направленность в изменении генов и хромосом.

Разработаны методы увеличения потомства ценных животных — производителей посредством гормональной стимуляции суперовуляции, т. е. одновременного созревания нескольких яйцеклеток, которые извлекают после оплодотворения и пересаживают приемным матерям менее ценных пород или менее продуктивным женским особям той же породы.

Принципиально решена проблема трансформации животных и растений с использованием клонированных генов. Достигнуты первые успехи в переносе генов между разными видами животных. Получены мыши, трансформированные вектором, содержащим ген гормона роста крысы и человека. Осуществляется межвидовой и межродовой перенос генов, кодирующих хозяйственно ценные белки у растений.

Большие надежды связывают с направленным изменением генов в составе плазмид in vitro. На основе этого метода ведутся работы по так называемой белковой инженерии, позволяющие изменять в нужном направлении ферменты, кодируемые этими генами. Стало актуальным применение методов генной инженерии при создании продуцентов для микробиологической промышленности.

Широко распространяются приемы размножения клеточной массы высших растений для производства ценных веществ, например алкалоидов женьшеня и раувольфии. Разрабатываются методы клеточной селекции высших растений. Большое внимание привлекает пока загадочное явление сомаклональной изменчивости растений — высокий уровень наследственной изменчивости, наблюдаемый при размножении растений с помощью регенерации из соматических клеток, выращиваемых в культуре.

То, что эти методы обогатят селекцию в ближайшее время, не вызывает сомнения. При этом необходимо помнить, что главным источником успеха в селекции, растениеводстве и животноводстве будет овладение механизмами эволюционного процесса.

Лекция № 9

ОСНОВЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Генная инженерия – раздел молекулярной биологии, связанный с конструированием in vitro новых комбинаций генетического материала, способного размножаться в клетке и синтезировать определенный продукт. Используя методы генной инженерии, сегодня можно заставить гены человека или животного «работать» в клетках микроорганизма или другого объекта и синтезировать нужный человеку продукт. Эта технология представляет большой практический интерес для медицины, сельского хозяйства, промышленности, поскольку отныне можно получать в необходимых количествах ранее дефицитные активные вещества и фармацевтические препараты.

Список биологически активных веществ, в которых заинтересована медицина и промышленное производство которых уже налажено или вполне реально в будущем, весьма обширен.

В их числе инсулин (для лечения при инсулинзависимом сахарном диабете), гормоны роста (для гормональной стимуляции роста при нанизме), интерферон α, β и γ (для лечения вирусных инфекций и преодоления несовместимости при пересадках органов и тканей), интерлейкин 2 (от заболевания иммунной системы), активатор профибринолизина (для борьбы с тромбозами), вакцина против гепатита В (для вакцинации), вакцина против ящура (для вакцинации скота), α₁-антитрипсин (для лечения эмфиземы легких), фактор крови VIII (для лечения гемофилии А), фактор крови IX (для лечения гемофилии В) и многие другие.

Генная инженерия решает такие важные задачи, как:

1. получение генов путем выделения их из клеток или синтеза;

2. получение рекомбинантных молекул ДНК;

3. клонирование генов;

4. введение генов в клетку и синтез чужеродного ей белка.

Решающую роль в этих экспериментах сыграли методы получения индивидуальных генов, наработка их препаративных количеств путем клонирования, т.е. практически неограниченного размножения в бактериальных клетках. В ходе разработки этих процедур была создана техника генной инженерии, включающая выделение индивидуальных фрагментов ДНК любого происхождения, их стабильное воспроизведение в составе векторов, идентификация функций клонированных таким образом генов, их изменение и введение в клетки исходного или иного организма. Эта техника, получившая также название техники рекомбинантной ДНК, в соединении с методами расшифровки первичной нуклеотидной последовательности генов сделали возможными эксперименты непосредственно на генетическом материале, манипулирование генами в научных и практических целях.

Получение генов

Первый успешный эксперимент по выделению гена, а точнее, группы генов лактозного оперона lac-оперона Е. coli, был выполнен в 1969 г. в лаборатории Дж. Беквита. Для этого использовали два трансдуцирующих бактериофага λ и φ80, включившие lac-оперон в свои геномы в противоположной ориентации по отношению к собственным генам. Эксперимент Дж. Беквита и других принято считать началом генной инженерии. Поскольку подход к выделению lac-оперона весьма специфичен для бактерии Е. coli, его сменили другие приемы, применяемые в работе с любыми организмами.

Главную роль на первом этапе выделения гена отводят эндонуклеазам рестрикции, или рестриктазам. Эти ферменты разрезают ДНК вблизи или внутри определенных последовательностей нуклеотидов, которые одинаковы на обеих комплементарных цепях. Два разрыва в одинаковых позициях комплементарных цепей на концах фрагмента образуют так называемые липкие концы, которые могут вновь замыкаться благодаря комплементарности оснований. Последовательности, узнаваемые рестриктазами, случайным образом разбросаны по геному. Чем короче последовательность, тем чаще она встречается и соответственно тем короче фрагменты ДНК, образующиеся при рестрикции. Ферменты рестрикции можно разделить по их молекулярной массе и заряду при помощи электрофореза в геле. В настоящее время из различных микроорганизмов выделено множество рестриктаз с неодинаковой специфичностью по отношению к нуклеотидным последовательностям ДНК.

Отыскание нужного гена среди смеси рестрикционных фрагментов представляет известные сложности. Наряду с этим наиболее распространенным способом получения генов существует также способ химического синтеза генов. Методология синтеза ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов была разработана Г. Кораной в 60-х годах прошлого века, задолго до наступления эры генной инженерии. После того как была расшифрована первичная структура первой индивидуальной нуклеиновой кислоты – аланиновой тРНК дрожжей, Г. Корана* с сотрудниками синтезировали химическим путем кодирующую часть гена для этой РНК размером 77 п. н. В 1976 г. в той же лаборатории был синтезирован ген тирозиновой тРНК Е. coli, который работал, будучи введенным в геном бактериофага Т4, в клетках кишечной палочки.

Методология, разработанная Кораной, широко используется для синтеза искусственных генов, в частности генов гормона человека инсулина, вводимых затем в бактериальные или дрожжевые клетки-продуценты. Сейчас созданы специальные автоматы для синтеза ДНК заданной последовательности. Те же подходы используют для синтеза так называемых ДНК-зондов – небольших фрагментов генов размером 20–30 п. н. Это возможно даже в тех случаях, когда известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка. Тогда, пользуясь таблицей генетического кода, можно вывести структуру соответствующего участка гена. Такие зонды используют для поиска нужной, комплементарной им мРНК.

Выведенную при помощи зонда мРНК используют затем для синтеза так называемой комплементарной ДНК (кДНК) с помощью фермента обратной транскриптазы.

Химический и энзиматический синтез генов имеет определенные преимущества перед их поиском среди рестрикционных фрагментов. Однако эти методы имеют и недостатки, поскольку синтетические гены чаще всего лишены ряда регуляторных элементов, необходимых для их полноценной экспрессии.

Клонирование генов

Для выделения нужного фрагмента ДНК в необходимых количествах его следует встроить в плазмиду – вектор, вскрытую той же рестриктазой, которую использовали для получения рестриктов геномной ДНК. В качестве векторов служат плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам. На первых этапах развития генной инженерии применяли естественные плазмиды Е. coli, например pSC101 или ColE1. В настоящее время работают с искусственными рекомбинантными плазмидами, которые несут два или три гена устойчивости, в которых содержится по одному уникальному сайту рестрикции для какой-либо рестриктазы. Это плазмиды pBR322, 324, 325 и др.

Широко используемая в экспериментах плазмида pBR322 несет гены устойчивости к ампициллину (Ap^r) и тетрациклину (Tc^r). В гене Ap^r находится уникальный сайт для рестриктазы Pst1, а в гене Tc^r – для BamH1. Вскрывая вектор pBR322 по сайту BamH1 в гене Tc^r в него можно встроить фрагменты, полученные при помощи той же рестриктазы путем взаимодействия липких концов. Ковалентное соединение вектора и клонируемого фрагмента завершает полинуклеотидлигаза in vitro или in vivo.

Если теперь сформировать клетки компетентной культуры Е. coli плазмидой pBR322 со встроенным в нее фрагментом, то трансформантов можно отобрать на среде с ампициллином. Затем необходимо их проверить по признаку устойчивости к тетрациклину.

Далее клонируемый фрагмент ДНК может быть ограниченно размножен в ходе клеточных делений трансформанта. Векторы типа плазмиды pBR322 называют векторами инактивации.

Способность ДНК вируса SV40 встраивать в свою молекулу чужую ДНК была показана в лаборатории П. Берга при получении гибридной молекулы ДНК из двух вирусов, один из которых – онкогенный вирус SV40, второй – дефектный фаг λ с включенным в него галактозным опероном Е. coli. Рестриктаза EcoRI разрезает кольцевые молекулы вирусов в строго определенном месте. Это переводит молекулы обоих вирусов из кольцевого состояния в линейное. Под действием фермента экзонуклеазы однонитевые участки расширяются на обоих концах каждой из двух линейных молекул. С помощью фермента концевой трансферазы наращиваются концевые участки поли-(dА) и поли-(dT). Тем самым создаются комплементарные однонитевые концы для обеих молекул. Подготовленные таким образом молекулы соединяются в кольцо. Затем, применяя обработку ДНК-полимеразой, застраивают однонитевые участки по комплементарным матрицам и посредством ДНК-лигазы замыкают гибридные кольца ковалентными связями. В результате галактозный оперон Е. coli оказывается включенным в ДНК вируса SV40.

Среди ферментов в работах по генной инженерии главное место занимают рестриктирующие эндонуклеазы, позволяющие получить однородные фрагменты ДНК, и лигазы, сшивающие фрагменты. Фрагменты рестрикции кодируются хромосомными и плазмидными генами. Фермент REcoRI, широко используемый в опытах по рестрикции молекул ДНК, кодируется генами R-плазмиды из клеток Е. coli. Рестриктазы узнают в ДНК определенные короткие последовательности нуклеотидов.

При разрезании двуцепочечных молекул ДНК концы фрагментов по месту разрыва могут сохранять двуцепочечную структуру.

Они получили название тупых концов (blunt ends). ДНК-лигаза фага Т4 способна соединять такие тупые концы молекул ДНК.

Для облегчения процесса сшивания на обоих тупых концах разрезанной молекулы ферментативно можно нарастить липкие концы (sticky ends). Такие липкие концы, возникающие в месте разреза двуцепочечной

ДНК, способны соединяться не только между собой, восстанавливая исходную кольцевую молекулу ДНК. Они соединяются и с любым другим фрагментом чужеродной ДНК, имеющим липкие концы, полученные при действии той же рестриктазы. При добавлении фермента полинуклеотидлигазы это соединение приобретает прочный ковалентный характер. Рекомбинантная плазмида с включенным в нее участком чужеродной ДНК становится плазмидным вектором. Введение в клетку и последующее размножение рекомбинантной плазмиды обеспечивают клонирование приобретенного ею чужеродного фрагмента ДНК.

Наряду с рекстриктазами и лигазами работа по рекомбинантным молекулам требует целого банка ферментов, таких, как нуклеазы, обратная транскриптаза, терминальная нуклеотидилтрансфераза, ДНК-полимераза I и др. Все эти ферменты видонеспецифичны. Это обстоятельство позволяет создавать рекомбинантные плазмиды, сочетающие генный материал от любых органических форм.

Методы секвенирования ДНК стали необходимой частью работ по генной инженерии. Без этого нельзя достичь нужного уровня молекулярно-генетического манипулирования с генами и их структурой. Секвенирование генов, введенных в рекомбинантные молекулы, позволяет полностью выяснить код гена, получить данные о полной последовательности в нем нуклеотидов. В качестве векторов используют ряд природных плазмид, а также векторы, искусственно сконструированные с помощью рестриктаз и лигаз.

Среди природных плазмид широко применяют колициногенную плазмиду ColE1. При добавлении к культуре бактерий хлорамфеникола она амплифицируется до 1000 копий на одну клетку Е. coli. Вместе с плазмидой в клетке клонируется и введенный в плазмиду фрагмент чужеродной ДНК. Известно несколько десятков систем рестрикции, которые позволяют получить самые различные структуры векторов.

Рекомбинантные ДНК

Рекомбинантная ДНК – это искусственно полученная ДНК, которая включает ген (гены), являющийся объектом генетических манипуляций, и вектор, обеспечивающий размножение рекомбинантной ДНК и синтез в клетке хозяина определенного продукта, кодируемого внесенным геном.

Векторы должны обладать следующими особенностями:

• иметь свойства репликона;

• нести субстратные участки для рестриктаз, без чего невозможна встройка ДНК;

• содержать один или несколько генов-маркеров, позволяющих по фенотипу констатировать факт его передачи.

Конструирование рекомбинантных молекул ДНК началось с получения гибридных ДНК между плазмидами. На рисунке представлена схема опыта, проведенного в 1978 г. М. Коеном, в котором удалось создать новую гибридную плазмиду, объединившую устойчивость к антибиотикам, которой обладали молекулы ДНК объединяемых плазмид.

Получены многочисленные факты переноса генов из клеток эукариот в клетки бактерии. Как подлинную сенсацию расценили ученые в 1974 г. результаты эксперимента по генной инженерии Дж. Морроу и сотрудников, которые использовали в качестве вектора ДНК плазмиды pSC101 E. coli и в качестве переносимого ген-специфичного материала – фрагмент ДНК из хромосомы африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), кодирующий синтез молекул рибосомной ДНК.

Фрагменты ДНК, детерминирующие синтез молекул рРНК (фрагменты рДНК), «пришивались» к плазмиде. Затем гибридными молекулами трансформировали Е. coli по признаку устойчивости к тетрациклину. Из клеток трансформантов выделяли плазмидную ДНК, изучали ее в градиенте плотности хлористого цезия, под электронным микроскопом проверяли ее способность к гибридизации с меченой рибосомной РНК X. laevis и исследовали, на какое число фрагментов она распадается под действием рестриктаз. Все тесты показали наличие генетического материала X. laevis в плазмидах, способных к репликации в клетках бактерии. Кроме того, была исследована способность этого материала, включенного в ДНК плазмиды, к транскрипции. Для этой цели были использованы так называемые мини-клетки, т.е. бактериальные клетки одного из мутантов, не содержащие в определенных условиях ДНК. Опыты показали, что в мини-клетках, трансформированных рекомбинантными плазмидами, осуществляется транскрипция генов из ДНК X. laevis.

В последующие годы ряд генов человека был введен в клетки бактерий, они синтезировали в них нужные белки человека.

В 1980 г. инсулин человека, введенный в клетку бактерии, кодировал в них синтез человеческого инсулина. Этот инсулин прошел испытания на людях и оказался очень эффективным. Инсулин, который в клетках бактерий кодировался геном человека, не вызывает побочных реакций, что свойственно инсулину, получаемому из поджелудочных желез свиней.

Непосредственное клонирование геномной ДНК все еще остается технически трудной задачей. Экспериментатор, желая выделить какой-либо ген, располагает для начала тремя источниками: белками, мРНК и геномной ДНК. Основой пока остается процедура, позволяющая по мРНК воспроизводить ДНК. Приведем для примера клонирование генов факторов крови. Сначала находят орган, в котором выделяемый ген экспрессируется активнее всего, т. е. уровень соответствующей мРНК в нем самый высокий.

После экстракции мРНК из такой ткани приступают к очень ответственному этапу – получению с мРНК ДНК-копий (комплементарную ДНК, или кДНК) с помощью обратной транскриптазы. Комплементарная ДНК намного более стабильна, чем соответствующая мРНК. Кроме того, в двухцепочечном виде ее можно интегрировать в плазмиду (бактериальную мини-хромосому), которую в свою очередь вводят в бактерию типа Е. coli. Такие плазмиды, используемые сейчас во всех лабораториях, где проводят работы по генной инженерии, происходят от дикого типа и несут в большинстве своем по два гена устойчивости к антибиотикам (например, к пенициллину и тетрациклину). Эти маркеры позволяют отбирать те бактерии, которые содержат плазмиду, а среди них в свою очередь те, у которых плазмида включила в себя кДНК. Поскольку кДНК встраивается внутрь гена устойчивости к пенициллину, такой «раздробленный» ген уже не работает, и бактерии вновь обретают чувствительность к антибиотику. Устойчивость же и тетрациклину при этом сохраняется. Следовательно, достаточно высеять бактерии на питательную среду с тетрациклином, чтобы отобрать из них содержащие плазмиду, а затем из последних – содержащие так называемую рекомбинантную плазмиду и чувствительные к пенициллину. Таким образом и получают соответствующий «банк кДНК».

Следующий этап состоит в том, чтобы среди 10⁴-10⁵ независимых бактериальных колоний определить те, которые содержат генетическую информацию об интересующем нас гене несвертывания крови.

Как среди десятков тысяч бактериальных колоний банка кДНК найти ту, которая содержит кДНК нужного белка? Для достижения этой цели приходится использовать несколько методов, ибо ни один из них в отдельности не гарантирует успеха. Один из этих методов заключается в использовании синтетического зонда, гомологичного нужной молекуле кДНК. Такой меченый зонд гибридизируется с кДНК, так что метка вводится во всю колонию. Этот метод позволил в одном из экспериментов (П. Толстовцев, Ж.-П. Лекок, 1987) за один раз выделить среди сотни других клонов клон кДНК фактора свертывания крови IX. Разработано также несколько упрощенных методик, использующих ту или иную априорную информацию.

Предположим, что известны лишь фрагменты аминокислотной последовательности этого белка. Зная генетический код, химик может синтезировать соответствующие им фрагменты ДНК длиной 14—18 п. н. Пометив их радиоактивным фосфором ³²Р, биолог может воспользоваться ими как молекулярным зондом для выявления тех бактериальных клонов, которые содержат соответствующую кДНК. Метод основывается на том, что кДНК гомологичных последовательностей способны связываться друг с другом. Колонию с кДНК, гомологичной какому-либо из меченых фрагментов, теперь легко определить после соответствующей экспозиции фотопленки. За последние годы эта методика была существенно усовершенствована во многом благодаря серьезным успехам в химическом синтезе ДНК.

Получение кДНК человека возможно в два этапа: после выделения гомологичной кДНК какого-либо животного ее уже можно использовать в качестве зонда. Две молекулы кДНК, например, мыши и человека способны соединяться так же эффективно, как и в случае двух близкородственных млекопитающих.

Ситуация усложняется, если аминокислотная последовательность неизвестна. Методика исследования в этом случае сводится к тому, чтобы заставить бактерии непосредственно считывать содержащуюся кДНК, после чего выявлять такие колонии специфическими антителами. Именно так в 1979 г. У. Гилберт со своей гарвардской группой провел клонирование кДНК инсулина человека.

Способность кДНК связываться с мРНК также нашла применение. После гибридизации каждую мРНК элюируют, после чего с нее считывают белок либо в бесклеточной системе, либо (после инъекции) в яйцеклетке земноводного. Белок характеризуют по его молекулярным свойствам и биологической активности. Так было с интерферонами α и β, клонированными в 1980 г.

Ученые постоянно разрабатывают новые методы, ускоряющие выделение клонов. Стало очевидным, что при выделении клонов следует использовать несколько методов одновременно. При таком подходе нужный клон кДНК всегда можно будет выделить.

После клонирования начинается «эксплуатация» кДНК. Ее подробное исследование позволяет быстро определить первичную структуру соответствующего белка. В большинстве случаев кДНК непосредственно используют для производства «своего белка». Но можно ее заменить, воспользоваться ею для выделения самого гена из банка геномной ДНК (гибридизацией). Изучение самих генов позволяет лучше понять их организацию и механизмы действия в организме.

Генная инженерия и векторы для клонирования растений

Опухолевое заболевание растений, получившее название корончатый галл, описал еще Аристотель в IV в. до н. э. В начале XX в. н. э. было установлено, что это заболевание вызывает почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens.

Клетки растительных опухолей интенсивно растут на искусственных средах при этом в отличие от клеток нормальных тканей не нуждаются в добавлении фитогормонов. В 70-х годах было установлено, что причиной образования опухолей являются так называемые Ti-плазмиды, обнаруженные в клетках некоторых штаммов A. tumefaciens. Ti-плазмиды – это кольцевые молекулы ДНК с молекулярной массой около 1,3 • 10⁸ Д и длиной до 200 тыс. п. н. Эти плазмиды проникают из бактерий в клетки растения, и часть ДНК Ti-плазмиды, получившая название Т-ДНК, ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения. При этом Т-ДНК вызывает образование опухоли и индуцирует синтез фитогормонов (цитокининов и ауксина), а также ряда производных аминокислот, объединяемых общим термином опины. Опины служат бактерии пищей. Этот механизм инфекции и используют для введения в растения чужеродных генов. Итак, операция сводится к включению нужного гена в сайт Т-ДНК и к трансформации клетки растения такой рекомбинантной плазмидой. Клетка должна регенерировать в полноценное растение, причем встроенный ген лишает Т-ДНК способности к образованию опухоли. Встраивание клонированного таким путем сегмента ДНК (трансгена) в ДНК клетки-хозяина и регенерация в полноценный организм – перспективный путь создания трансгенных организмов, как растений, так и животных.

Ti-плазмида относится к классу конъюгативных плазмид. В качестве векторов для клонирования генов и последующей трансформации растений используют две ее разновидности. Они различаются по типу опинов, которые синтезируют зараженные ими растения. У одной синтезируются октопины, у другой – нопалины. Клонируемый ген встраивают вместо кодирующей части генов октопинсинтетазы или нопалинсинтетазы, вхрдящих в состав Т-ДНК.

1. В настоящее время выделены и проклонированы десятки генов высших растений, в том числе гены, контролирующие синтез запасных белков ячменя, кукурузы, гороха, сои, а также гены, контролирующие активность ферментов; некоторые гены хлоропластов пшеницы, шпината и других растений. С начала 80-х годов прошлого века введение в клетки растений чужеродных генов стало свершившимся фактом.

Для улучшения сортов нужный ген вводят в растительную клетку с помощью специальных векторов (рекомбинантных плазмид Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes). Затем из трансформированной клетки методом культуры тканей регенерируют полноценное растение с новыми биологическими свойствами, дающее семена нового сорта. Этот процесс показан на рисунке, где представлены генно-инженерные манипуляции с растениями при участии этих бактерий. Agrobacterium tumefaciens вызывает у растений рак. Бактерия содержит плазмиду Ti, сегмент которой (Т-ДНК) способен встраиваться в хромосомную ДНК растительной клетки. Инфекция индуцирует синтез соединений – опинов, которые служат бактерии пищей.

Используя данный метод, удалось выделить ген устойчивости к гербицидам, который был перенесен в клетки табака, чтобы попытаться регенерировать из них устойчивые растения. Группа исследователей из США трансформировала клетки подсолнечника геном фазеолина (резервного белка фасоли), который хорошо экспрессировался в регенерировавших растениях и передавался потомству. Другая группа ученых успешно пересадила ген одного из ферментов фотосинтеза (точнее, малой субъединицы этого фермента), который экспрессируется у полученного потомства.

Использование в качестве вектора рекомбинантной плазмиды бактерии Agrobacterium rhizogenes имеет некоторую специфику. Она обладает плазмидой Ri, в которой также содержится Т-ДНК, способная встраиваться в хромосомную ДНК растительных клеток. В данном случае Т-ДНК вызывает обильное корнеобразование — синдром косматого корня (hairy-root). Эта Т-ДНК функциональна, поскольку трансформированные клетки корней синтезируют опины. Преимущества данного вектора (в сравнении с плазмидой Ti) состоят в том, что регенерация из корней представляется намного более простой и быстрой, чем из клеток раковой опухоли.

Для создания трансгенных сельскохозяйственных растений сейчас начали применять методы, альтернативные генетической трансформации. В частности, широко практикуется доставка вектора в мишень с помощью высокоскоростной баллистической трансфекции. Сделана попытка создать альтернативную технологию введения чужеродной ДНК в растительную клетку методом электрофореза в геле на агар-агаре.

Использование методов генной инженерии позволяет решать самые разнообразные селекционные задачи. Особенно большие успехи достигнуты при переносе в растения генов устойчивости к болезням, вредителям, гербицидам и др.

Так, немецкая фирма АО «Кляйнванцделебенер Заатцухт», используя методы генной инженерии и стерильной культуры меристемы, успешно проводит селекцию сахарной свеклы по двум перспективным целевым проектам: по изучению устойчивости к ризомании и перенесению контролирующего ее гена в клетки сахарной свеклы и по селекции с помощью генетических маркеров. При таком подходе свойства будущей линии, гибрида или сорта, например, устойчивость к той или иной болезни, которая контролируется определенными генами, можно предвидеть уже в лаборатории.

Ризомания, или бородатость корня сахарной свеклы, - одно из наиболее серьезных заболеваний этой культуры. Оно широко распространено и вызывает снижение урожайности на 50 % и более. Во многих районах с зараженными ризоманией площадями выращивание сахарной свеклы возможно только при использовании устойчивых сортов. Еще лучше по сравнению с последними показывают себя сорта с так называемой полной резистентностью, которые можно получить только методами генной инженерии.

Для формирования резистентности к ризомании из вируса, вызывающего заболевание (некротический желтый вирус прожилок листьев), в клетку свеклы переносят предварительно изолированный отрезок гена, ответственного за синтез протеина оболочки вируса. Растение, обладающее этой новой дополнительной генетической информацией, производит в клетке свеклы пустую вирусную оболочку и, таким образом, блокирует развитие самого вируса при его внедрении в клетку.

Сорта сахарной свеклы с полной резистентностью к вирусу ризомании имеют огромные преимущества. Некоторые из таких сортов, например Дора и Габриэла, были созданы уже несколько лет назад.

Полагают, что генная инженерия особенно перспективна при изучении процессов развития и дифференциации растений, что поможет в будущем правильнее организовать селекционный процесс. Молекулярная биология предложила несколько интересных вспомогательных методов. Так, Р. Оуэне и Т. Динер (1981) в США использовали фрагменты ДНК (зонды) для выявления вируса крайне опасной болезни картофеля – веретеновидности клубней, показав тем самым простой метод диагностики. Исследователям из Института растениеводства в Кембридже (Великобритания) удалось таким способом идентифицировать в геноме пшеницы фрагменты хромосом ржи после скрещивания этих видов между собой.

Примеры использования генной инженерии не ограничиваются приведенными. Одним из перспективных направлений ее применения считают придание растениям устойчивости к поздним весенним и ранним осенним заморозкам, которые причиняют сельскому хозяйству огромный ущерб. Однако не следует забывать, что селекция новых сортов затрагивает свойства, контролируемые очень многими генами одновременно, и невозможно все их подвергнуть генно-инженерным манипуляциям.

Генная инженерия в животноводстве

Открытия в области структуры генома, сделанные в середине прошлого века, дали мощный толчок к созданию принципиально новых систем направленного изменения генома живых существ. Были разработаны методы, позволяющие конструировать и интегрировать в геном чужеродные генные конструкции. Одним из таких направлений является интеграция в геном животных генных конструкций, связанных с процессами регуляции обмена веществ, что обеспечивает последующее изменение и ряда биологических и хозяйственно полезных признаков животных.

Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые признаки, которые при селекции закрепляются в потомстве. Так создают трансгенные линии.

Трансгенных животных получают путем микроинъекции рекомбинантной ДНК в извлеченные из донорских организмов эмбрионы и дальнейшей пересадки инъецированных эмбрионов в яйцеводы или после культивирования в матку синхронизированных реципиентов. Эффективность получения трансгенных животных во многом зависит от чистоты и концентрации инъекционного раствора ДНК. Для трансформации генов в геном животного используют: микроинъекцию ДНК в пронуклеус зигот или каждый бластомер двухклеточного эмбриона; введение ДНК с помощью ретровирусных векторов; получение трансгенных химер из генетически трансформированных клеток и эмбрионов.

Одни из важнейших задач сельскохозяйственной биотехнологии – выведение трансгенных животных с улучшенной продуктивностью и более высоким качеством продукции, резистентностью к болезням, а также создание так называемых животных-биореакторов – продуцентов ценных биологически активных веществ.

С генетической точки зрения особый интерес представляют гены, кодирующие белки каскада гормона роста: непосредственно гормон роста и рилизинг-фактор гормона роста.

Следует напомнить, что рилизинг-фактор гормона роста стимулирует синтез и секрецию гормона роста. Гормон роста является регулятором многих процессов обмена веществ, в том числе белкового и липидного.

По данным Л. К. Эрнста, у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста толщина шпика была на 24,3 % ниже контроля. Существенные изменения отмечены по уровню липидов в длиннейшей мышце спины. Так, содержание общих липидов в этой мышце у трансгенных свинок было меньше на 25,4 %, фосфолипидов – на 32,2, холестерина – на 27,7 %.

Таким образом, трансгенные свиньи характеризуются повышенным уровнем ингибирования липогенеза, что представляет несомненный интерес для практики селекции в свиноводстве.

Потери в животноводстве, вызванные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению возбудителей и их размножению препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх⁺-мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх⁺ был выделен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены.

Ведутся исследования, направленные на получение трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лактоферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистентность к аденовирусу Н5 (Ad5) на уровне 90-98 %, более высокую по сравнению с контрольными линиями клеток. Л.К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза.

Показана возможность конструирования системы внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов с участием мутантных форм эндогенных вирусных белков, защищающих от соответствующих вирусов. Так, получены трансгенные куры, устойчивые к лейкозу, у которых в клетках присутствовал белок вирусной оболочки.

Очень важно использование трансгенных животных в медицине и ветеринарии для получения биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающих у них синтез новых белков.

Трансгенные животные как продуценты ценных биологически активных белков и гормонов имеют ряд преимуществ перед микроорганизмами и клеточными системами. Важно, что новые белки, получаемые в линиях клеток трансгенных животных, могут быть модифицированы, их активность сравнима с активностью протеинов. Для молочного производства большой интерес представляет получение целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы для выхода белков с молоком. Один из основных этапов получения трансгенных животных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, – идентификация промотора, направляющего экспрессию структурных генов в секреторный эпителий молочной железы.

В настоящее время выделены гены и промоторы αSI-казеина, β-казеина, α-лактоальбумина, β-лактоглобулина и сывороточного кислого протеина (WAP). Молочная железа – великолепный продуцент чужеродных белков, которые можно получать из молока и использовать в фармацевтической промышленности. Из молока трансгенных животных извлекают следующие рекомбинантные белки: человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, α-1-антитрипсин, тканевой плазменный активатор, лактоферин, сывороточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназу и химозин. В большинстве проектов, за исключением α-1-антитрипсина и химозина, эти исследования пока еще ведутся в основном на трансгенных мышах, поэтому оценивать их с точки зрения коммерческого интереса еще рано.

1. США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отвечающий за экспрессию β-лактоглобулина, который спосрбен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном α-1-антитрипсина человека и β-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомбинантных белков в системах с использованием культуры клеток составляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может повышаться до 1 л. Следует отметить, что процедуры по созданию клеточных культур и их выращиванию в промышленных реакторах, а также по выведению трансгенных животных и их обслуживанию весьма дороги. Однако трансгенные животные легко размножаются, содержание их сравнительно дешево, что делает этих животных хорошими продуцентами разнообразных белков с низкой стоимостью. В России группой ученых под руководством Л. К. Эрнста и М. И. Прокофьева получены трансгенные овцы с геном химозина – основного компонента для производства сыра. В 1 л молока содержится 200-300 мг химозина. Стоимость его будет в несколько раз ниже продукта, получаемого традиционным способом из сычугов молочных телят и ягнят. Так, из 3 л молока трансгенной овцы можно получить достаточное количество химозина для производства 1 т сыра из коровьего молока.

Ксенотрансплантация. Благодаря трансплантации были спасены жизни более 200 000 человек. В США трансплантации сердца ожидают около 45 000 человек, однако ежегодно лишь 2000 человек получают «новое» сердце. В качестве доноров органов могут быть использованы трансгенные животные. Лучше всего из домашних животных для этого подходят свиньи, поскольку их органы и органы человека имеют сходный размер, анатомию и физиологию. Основной проблемой при ксенотрансплантации является реакция отторжения чужеродных органов. При этом различают 1) гиперострое отторжение (от секунд до нескольких минут), которое вызвано быстрой активацией системы комплемента реципиента; 2) острое отторжение (сутки), обусловленное реакцией Т-клеток, встречается также при пересадке органов от одного человека другому; 3) хроническое отторжение (до нескольких лет), точные причины которого пока не установлены. При пересадке органов из организма другого вида первоочередной задачей является предотвращение гиперострого отторжения. С этой целью были выведены трансгенные свиньи, у которых в каскаде реакций комплемента принимают участие некоторые факторы человека. В первую очередь речь идет о hCD55 (фактор усиления распада, DAF). Приматы, которым пересаживали сердца трансгенных свиней с этим фактором, жили до 40 дней, тогда как контрольные животные с сердцами от нетрансгенных доноров погибали в течение нескольких минут.

Еще один подход к решению задачи ксенотрансплантации человеческих тканей или органов животным – получение линий иммунодефицитных животных, иммунная система которых из-за врожденных генетических особенностей не способна реагировать на чужеродные антигены. При определенных условиях у таких животных способны приживляться человеческие клетки, ткани и фрагменты органов.