Вирусологический метод
Обнаруживают ротавирусы в первично-трипсинизирован-ных культурах клеток почек обезьян и человека (бляшкообразование) и перевиваемых при условии протеолитической активации трипсином.
Идентифицируют в реакции нейтрализации (РН).
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. Наиболее распространен для индикации ротавирусного антигена в клинических образцах.
РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)
Используют прямой и непрямой варианты.
РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ. В качестве исследуемого материала обычно берут фекальные пробы.
РЕАКЦИЯ ДИФФУЗНОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ
РЕАКЦИЯ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИИ
(используют полистирольные латексы с предварительно адсорбированным АТ),
МГ, ПЦР.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Антитела к ротавирусам и нарастание титров антител определяют в РСК, РН вирусов в культуре клеток, РТГА(эритроциты человека нулевой группы, эритроциты морской свинки), РИФ.
Прионные болезни
Прионные болезни – особый класс смертельных нейродегенеративных заболеваний человека и животных, возбудителем которых является прион – безнуклеиновый низкомолекулярный белок, устойчивый к инактивирующим воздействиям.
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ
Тема актуальна и связана со вспышкой «коровьего бешенства» в Великобритании, а также с выявлением в европейских странах молодых людей, страдающих так называемым «новым вариантом» болезни Крейтцфельда-Якоба.
Открытие прионов дало начало новой эре развития биологии и медицины, поскольку был выявлен новый тип инфекционных заболеваний и привело к тому, что была сломана догма молекулярной биологии о невозмож-ности передачи белком наследственной информации
Загадка наследственности волновала людей во все времена. Лишь в 1944 году удалось выяснить, что наследственная информация хранится в молекулах ДНК. Молекула ДНК может удваиваться, и эти копии передаются потомству. А на основе информации, записанной в ДНК, синтезируются все белки, которые и определяют признаки организма.
В последующем, исследования онковирусов и ВИЧ показали, что наследственная информация может передаваться и от РНК к ДНК с помощью специального фермента – обратной транскриптазы. Открытие прионов требует внесения серьёзных корректив и признания того, что информация может передаваться потомству не только через нуклеиновые кислоты, но и с помощью белков.
Врач любой специальности должен иметь представление о данной проблеме. Знание темы необходимо для дальнейшего изучения прионовых заболеваний на кафедрах инфекционных болезней, эпидемиологии, психиатрии, нервных болезней, внутренних болезней и др.
* Первые упоминания о прионной патологии относятся к XVIII веку и касаются вспышки болезни среди овец во Франции, известной сегодня как скрепи (scrapie – чесотка овец).
Раньше называли – тря-сущаяся болезнь, зудящая болезнь.
* Основные симптомы заболевания: сильный зуд, животные худеют, кожа лысеет, трескается, загнивает, наступает смерть.
Проблема прионных болезней для медицинской науки родилась в рамках учения о медленных инфекциях.
В 1954 г. были изложены результаты многолетних исследований скрепи овец и выделены 4 главных признака медленных инфекций:
1) длительный инкубационный период;
2) медленное прогрессирование;
3) необычность поражения органов и тканей;
4) неизбежность смертельного исхода
В 1957 году американский вирусолог Гайдусек описал новое заболевание «куру» среди жителей Папуа-Новой Гвинеи. Болезнь носила массовый характер и связана была с употреблением сырого мозга. По ритуалу мозг умершего съедали родственники.
В 1959 году было выявлено клинико-морфологическое сходство куру и скрепи и т.о. доказано наличие медленных инфекций у человека.
Микроскопическое изучение мозга больных папуасов показало изменения, типичные для губчатой энцефалопатии.
Губчатая энцефалопатия была известна как болезнь Крейцфельда-Якоба. Встречается у 1 на миллион жителей Земли. К этой же группе болезней относятся еще более редко встречающийся синдром Гертсмана и недавно открытая фатальная семейная бессонница.
Высказано предположение, что сюда же следует отнести болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и любое старческое слабоумие.
Характеристика возбудителя
Инфекционная природа указанных болезней была признана всеми. Никто не сомневался, что возбудитель – это какое-то микроскопическое существо. Микробную природу болезни довольно быстро исключили. Довольно долгое время предполагали, что возбудителями являются вирусы и думали, что другого быть не может.
Поэтому предположения профессора Калифорнийского университета (США) Прусинера о том, что возбудителями губчатых энцефалопатий могут быть белки встретили скептически. Но ученый оказался прав. Потребовалось 10 лет работы, стадо животных, чтобы доказать инфекционность прионов. За открытие прионов Прусинер был удостоен в 1997 году Нобелевской премии.
* Впервые такой белок был выделен в 1982 году благодаря разработанной методике многоступенчатой очистки пораженной части мозга. Анализ показал, что инфекционным агентом является белок с молекулярной массой 27- 30 кДа, обозначенный как РrP 27-30.
* Отсутствие ДНК или РНК в составе инфекционного агента подтвердилось его устойчивостью к воздействию факторов инактивирующих нуклеиновые кислоты.
В 1985 г. в лаборатории И.Вайссмана был выделен ген, получивший название PRNP. Но оказалось, что этот ген содержится в ДНК как скрепи – инфицированных, так и здоровых животных. Это говорит о том, что прионный белок необходим для нормального функционирования организма. И действительно, прионный белок играет роль в выживании клеток Пуркинье, в регуляции сна. Нарушение нормы – фатальная семейная бессонница.
Прусинер обнаружил, что прионные белки способны существовать в двух различных формах.
PrP SC - «неправильный» белок-прион, вызывающий инфекцию (S – scrapie)
PrP C —правильный прион, присутствующий в нервной ткани.
Абсолютно одинаковые по составу, эти две формы сильно различаются по своей пространственной структуре. Белковая молекула нормального приона имеет форму спирали. Когда же молекула раскручивается и начинает походить на пучок гладких волос, прионы становятся смертельно опасными. Если белок находится в обычной форме, он хорошо растворяется в биологических жидкостях и способен выполнять свойственную ему функцию. Оказавшись в аномальной форме, он образует нерастворимые агрегаты и выступает как чужеродное для организма тело. Но это ещё не всё.
Было открыто явление, с которым биологи никогда раньше не встречались.
Прионы имеют способность переводить другие белки тоже в прионную форму - по принципу "домино". В результате организм свои собственные белки принимает за чужеродные и инактивирует их, переводя в нерастворимую форму. Накапливаясь в клетке, эти белки и убивают её.
Прионы устойчивы к
§ кипячению в течение 30-60 минут,
§ высушиванию до 2 лет,
§ замораживанию в 3 раза большему, чем известные вирусы,
§ химической обработке спиртами, формальдегидом, кислотами,
§ к УФ-облучению,
§ гамма-излучению,
§ гидролизу ферментами.
Наиболее эффективные воздействия оказываются в дозах, которые денатурируют практически все белки. Иначе говоря, из всего живого прион погибает последним.
ПУСКОВОЙ МЕХАНИЗМ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА
Для развития заболевания в организме должна появиться патологическая форма прионного белка. Откуда же он берётся, как попадает в организм?
Ø В результате мутации гена PRNP (эндогенная патологическая форма)
Ø В результате проникновения инфекционных частиц извне (экзогенная патологическая форма).
Мутация гена PRNP может носить наследственный характер и проявляться в любом возрасте.
Источник инфекции – больной человек, больное животное (овцы, коровы).
Пути передачи прионного белка
• Алиментарный
1. При вскармливании обезьянам зараженной мозговой ткани у них развивалась прионная инфекция
2. Этим путём передаётся куру
3. Новый вариант БКЯ связанный с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота
• Парентеральный
В 1974 г. Был зарегистрирован первый случай развития БКЯ у реципиента после пересадки роговицы от донора с БКЯ
В настоящее время известно множество случаев прионных болезней, связанных с пересадкой роговицы и твёрдой мозговой оболочки, с нейрохирургическими манипуляциями, терапией гормонами и т.п.