Praktikum-BH-1
.pdfНа сухую чашку Петри, под которую подложен лист белой бумаги для лучшей визуализации результатов, нанести 2 кап желчи, 2 кап 20% раствора сахарозы и тщательно перемешать стеклянной палочкой, затем прилить 7 кап концентрированной H2SO4 и вновь перемешать. Через 2-3 мин отметить появление окраски.
РЕЗУЛЬТАТ:
III.2. Контрольные вопросы.
Какие условия нужны для переваривания липидов?
В каком отделе желудочно-кишечного тракта и под действием каких ферментов происходит основной распад липидов и почему?
Какие Вы знаете промежуточные и конечные продукты переваривания триглицеридов, фосфолипидов?
Как и в каком отделе желудочно-кишечного тракта происходит всасывание продуктов переваривания липидов?
Какие фосфолипиды Вы знаете? Что такое лизофосфатидилхолины? Что такое парные желчные кислоты?
Материал для самоподготовки.а)1. с.363-370; II, III
Занятие № 24
ТЕМА. ОКИСЛЕНИЕ И СИНТЕЗ ЖИРНЫХ КИСЛОТ. МЕТАБОЛИЗМ КЕТОНОВЫХ ТЕЛ. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕ-ЛЕНИЕ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В КРОВИ.
Цель занятия: 1.Усвоить химизм и значение -окисления высших жирных кислот в тканях.
2.Уяснить процесс синтеза ВЖК в тканях.
3.Знать метаболизм кетоновых тел.
4.Овладеть методами качественного определения кетоновых тел и количественного определения триглицеридов в сыворотке крови.
Исходный уровень знаний:
-особенности строения ВЖК - компонентов липидов человека;
-структура нейтральных жиров;
-классификация и номенклатура ферментов;
81
- строение и биологическая роль витаминов РР, В2, В3, Н. Содержание занятия.
I.2. Окисление ВЖК в тканях: локализация в клетке, химизм, энергетический выход (в молекулах АТФ).
Окисление глицерина в тканях.
Энергетический баланс окисления триацилглицеринов.
Синтез ВЖК: локализация в клетке, последовательность реакций, ферменты.
Участие витаминов в процессах окисления и синтеза ВЖК. Современные представления о синтезе кетоновых тел (локализация в организме, химизм, значение).
II.1. Работа № 1. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА АЦЕТОН И АЦЕТОУКСУСНУЮ КИСЛОТУ.
К кетоновым телам относятся ацетон, -оксимасляная и ацетоуксусная кислоты. В крови в норме они содержатся в очень небольшом количестве - 13,4-185,2 мкмоль/л (0,14-1,9 мг%). В моче обычными реакциями ацетоновые тела у здоровых людей не определяются.
а) Проба Легаля на ацетон. Принцип метода и химизм реакции.
Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия продукт оранжево-красного цвета.
СН3-СО-СН3 + Na2[Fe(CN)5NO] + 2NaOH aцетон нитропруссид натрия
Na4[Fe(CN)5NO=CH-CO-CH3] + 2H2O
комплексное соединение
После подкисления ледяной уксусной кислотой образуется соединение вишневого цвета.
Na4[Fe(CN)5NO=CH-CO-CH3] + CH3COOH
Na3[Fe(CN)5-NO-CH2-CO-CH3] + CH3COONa
Порядок выполнения работы.
В пробирку внести 1 кап мочи, 1 кап. 10% раствора NaOH и 1 кап. нитропруссида Na. Отметить окраску. Добавить 3 кап. ледяной уксусной кислоты.
РЕЗУЛЬТАТ:
82
б) Проба Герхарда на ацетоуксусную кислоту. Принцип метода и химизм реакции.
Енольная форма ацетоуксусной кислоты вступает в реакцию с хлорным железом с образованием комплексного соединения вишнево-
красного цвета .При стоянии окраска бледнеет вследствие спонтанного декарбоксилирования ацетоуксусной кислоты.
Порядок выполнения работы.
К 5 кап. мочи прибавить по каплям 5% раствор хлорного железа. Зафиксировать появление сначала осадка (FeРО4), а затем окрашивания.
N.B. При кипячении процесс протекает очень быстро. Сходное окрашивание возможно после приема салициловой кислоты, антипирина и др. лекарственных препаратов, но при этом окраска при стоянии и кипячении не исчезает.
РЕЗУЛЬТАТ:
Клинико-диагностическое значение.
Гиперкетонемия и кетонурия наблюдаются при сахарном диабете, приеме кетогенной пищи (дефицит углеводов), голодании, гипер-
продукции гормонов (антагонистов инсулина), напр., кортикостероидов, болезни Гирке.
Гипокетонемия не имеет диагностического значения.
При сахарном диабете, когда печень бедна гликогеном, происходит усиленный распад жиров как источника энергии. В результате окисления ВЖК накапливается ацетил-КоА, что способствует его конденсации с накоплением кетоновых тел.
В раннем детском возрасте продолжительные желудочнокишечные заболевания (дизентерия, токсикозы) могут вызвать кетонемию в результате голода и истощения.
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРИДОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Принцип метода.
83
|
липаза |
|
|
Триацилглицериды |
→ глицерин + жирные кислоты |
||
глицерокиназа |
|
|
|
Глицерин + АТФ |
→ |
глицерил-3-фосфат + АДФ |
|
|
ГФО |
|
|
Глицерил-3-фосфат + О2 → |
диоксиацетонфосфат + 2Н2О2 |
||
|
|
пероксидаза |
|
Н2О2 + 4-ААР + 4-хлорфенол |
→ |
хинонимин + 4 Н2О |
Концентрация хинонимина, определяемая фотометрически, пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе.
Порядок выполнения работы
Реактивы (мл) |
Р-р сравнения |
Эталон |
Проба |
Рабочий реагент |
2,0 |
2,0 |
2,0 |
Дистиллированная |
0,02 |
- |
- |
вода |
|
|
|
Калибратор |
- |
0,02 |
- |
Сыворотка крови |
- |
- |
0,02 |
|
Содержимое пробирок перемешать, инкубиро- |
||
|
вать не менее 15 мин. при t=26-250Сили 10 мин |
||
|
при t=370С |
|
|
Измерить оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кювете 1 см при длине волны 500 нм (490-520 нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого света.
РАСЧЕТ. По оптической плотности пробы (А) и калибратора (Б) рассчитать содержание триглицеридов (Х) пробы по формуле:
Х = А : Б • 200 мг/100мл
или Х = А : Б • 2,29 ммоль/л
В норме содержание триглицеридов в сыворотке крови состав-
ляет 0,15-1,71 ммоль/л или 13-160 мг/100 мл.
Группа риска - 1,71- 2,29 ммоль/л или 160-2060 мг/100 мл Патологические показатели - >2,29 ммоль/л или 2000 мг/100 мл
84
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы. Какие Вы знаете кетоновые тела?
Каково содержание кетоновых тел в крови в норме? Где синтезируются кетоновые тела?
Как называется повышенное выделение кетоновых тел с мочой? Каковы причины кетонурии?
Какова роль триацилглицеринов в организме?
Как подсчитывается энергетическая ценность окисления триацилглицеринов?
Сколько в норме в сыворотке крови триглицеридов?
Материал для самоподготовки. а)1 с.363-39; II, III
Занятие № 25
ТЕМА. БИОСИНТЕЗ ЛИПИДОВ И ХОЛЕСТЕРИНА. РЕГУЛЯ-ЦИЯ И НАРУШЕНИЯ ЛИПИДНОГО ОБМЕНА. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА.
Цель занятия: 1.Изучить обмен холестерина у человека. 2.Усвоить синтез триглицеридов и фосфоглицеридов. 3.Ознакомиться с регуляцией и патологией липидного обмена. 4.Овладеть методом количественного определения холестерина в сыворотке крови (по Ильку).
Исходный уровень знаний:
-строение и классификация липидов;
-регуляция активности ферментов;
-строение ц-АМФ, АТФ, ЦТФ;
-жирорастворимые витамины. Содержание занятия.
I.2. Синтез и ресинтез триглицеридов.
Пути синтеза и ресинтез глицерофосфолипидов.
85
Синтез холестерина: локализация в организме, этапы, химизм I стадии.
Биологическое значение и структура стероидов - производных холестерина.
Выведение холестерина из организма. Липопротеиды: виды, состав.
Регуляция липидного обмена: роль ЦНС, эндокринной системы, ц- АМФ.
Патология липидного обмена: причины, симптоматика, примеры энзимопатий.
II.1. Работа № 1. РЕАКЦИЯ ЛИБЕРМАННА-БУРХАРДТА НА ХОЛЕСТЕРИН.
Холестерин и его эфиры содержатся в различных тканях и жидкостях животных: головном мозге, кожном сале, крови, желчи. В мозге холестерин в норме присутствует почти исключительно в свободном виде, а не в виде эфиров. В белом веществе мозга содержится 4-5% холестерина на влажную массу.
Принцип метода.
Раствор холестерина в хлороформе дает с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой красное окрашивание, перехо-
дящее затем в синее и зеленое. Под действием концентрированной серной кислоты происходит отщепление воды от вторичного спирта холестерина с последующей конденсацией непредельных углеводородов, соединяющихся с серной кислотой, и образованием окрашенных продуктов.
Порядок выполнения работы.
К 1 мл хлороформного экстракта из мозга добавить 10 кап уксусного ангидрида и 2 кап. концентрированной H2SO4 и хорошо перемешать. Отметить изменение окраски.
РЕЗУЛЬТАТ:
Работа № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕ-РИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Принцип метода.
Холестерин взаимодействует с ацетангидридом и серной кислотой с образованием соединения зеленого цвета. Интерференция белков подавлена 2,5-диметилбензосульфоновой кислотой.
86
Порядок выполнения работы.
Реактивы (мл) |
|
Р-р сравнения |
Эталон |
|
Проба |
Сыворотка крови |
|
- |
- |
|
0,1 |
Стандартный –р |
|
- |
0,1 |
|
- |
(реактив 1) |
|
|
|
|
|
Дистиллированная |
|
0,1 |
- |
|
- |
вода |
|
|
|
|
|
Реактив 2 |
|
3,0 |
3,0 |
|
3,0 |
|
Перемешать, на водяную баню t=20оС |
||||
|
на 5 мин. |
|
|
|
|
Реактив 3 (Н2SO4) |
|
0,6 |
0,6 |
|
0,6 |
|
Быстро перемешать, на водяную баню t=20оС |
||||
|
на 10 мин. |
|
|
|
|
Измерить оптическую плотность пробы и эталона против рас- |
|||||
твора сравнения в кювете 1 см при длине волны 560-590 нм. |
|
||||
РАСЧЕТ: |
|
|
|
|
|
|
|
А1 |
|
|
|
Х = |
, где |
|
|
|
|
|
|
А2 |
|
|
|
Х - количество холестерина в ммоль/л А1 – оптическая плотность пробы А2 – оптическая плотность стандарта.
РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
Клинико-диагностическое значение.
При нарушении жирового обмена холестерин может накапли-
ваться в крови. Увеличение содержания холестерина в крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, механической желтухе, нефрите, нефрозе (особенно при липоидных нефрозах), гипотиреозе.
Понижение холестерина в крови (гипохолестеринемия) наблю-
87
дается при анемиях, голодании, туберкулезе, гипертиреозе, раковой кахексии, паренхиматозной желтухе, поражении центральной нервной системы, лихорадочных состояниях, при введении инсулина.
III.2. Контрольные вопросы.
В каком виде холестерин содержится в сыворотке крови и тка-
нях?
В чём заключается физиологическое значение холестерина? Какова нормальная концентрация холестерина в сыворотке кро-
ви?
При какой патологии наблюдается гиперхолестеринемия? Когданаблюдается гипохолестеринемия?
Назовите исходные вещества для синтеза холестерина. Предшественником каких биологически активных соединений
является холестерин?
Материал для самоподготовки. а)1 с.392-408, 556-558, 574-577, 245, 454; II, III
Занятие № 26
КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛУ: "ОБМЕН И ФУНКЦИИ ЛИПИДОВ".
Вопросы к коллоквиуму.
1.Общая характеристика и классификация липидов. Биологическая роль в организме. Пищевые липиды, норма суточного потребления.
2.Переваривание и всасывание липидов в желудочнокишечном тракте (особенности переваривания и всасывания жиров у детей раннего возраста).
3.Переваривание и всасывание сложных липидов (на примере глицерофосфолипидов) в желудочно-кишечном тракте.
4.Желчные кислоты и их роль в процессе пищеварения.
5.Ресинтез триацилглицеринов в кишечной стенке и синтез их
втканях. Физиологическое значение.
6.Ресинтез фосфоглицеролипидов в кишечной стенке и синтез их в тканях. Физиологическое значение.
7.Пути поступления липидов в ткани. Липопротеиды крови: особенности строения, состава и функции.
88
8.Роль хиломикронов в обмене жиров. Депонирование липидов в жировой ткани. Концентрация липидов в крови.
9.Значение метионина и холина для обмена липидов.
10.Внутриклеточный липолиз. Каскадный механизм активации
липазы.
11.Транспорт и утилизация жирных кислот, образующихся при мобилизации жиров. Изменение скорости использования жирных кислот в зависимости от ритма питания и мышечной активности.
12.Бета-окисление высших жирных кислот (ВЖК). Последовательность реакций, связь с цитратным циклом и дыхательной цепью. Физиологическое значение.
13.Окисление глицерина в тканях. Энергетическая ценность этого процесса.
14.Энергетический баланс окисления триацилглицеринов в тка-
нях.
15.Биосинтез ВЖК: последовательность реакций, место синтеза, физиологическое значение.
16.Участие витаминов в окислении и синтезе ВЖК. Роль пентозофосфатного пути обмена глюкозы для синтеза ВЖК. Зависимость скорости биосинтеза от ритма питания и состава пищи.
17.Кетоновые тела: место, химизм, регуляция синтеза. Утилизация кетоновых тел. Физиологическая концентрация кетоновых тел в крови, изменение этого показателя при сахарном диабете и голодании.
18.Представления о биосинтезе холестерина: химизм I стадии, регуляция процесса. Выведение холестерина из организма. Физиологическая концентрация холестерина в крови.
19.Холестерин как предшественник стероидных гормонов, желчных кислот, витамина Д.
20.Роль липопротеидов в обмене холестерина. Гиперхолестеринемия: ее причины и последствия. Современные биохимические основы атеросклероза.
21.Регуляция липидного обмена. Влияние адреналина, глюкагона, инсулина на мобилизацию и депонирование липидов. (Неустойчивость жирового обмена у детей, характер проявления и факторы, ее определяющие.)
22.Патология липидного обмена, обусловленная нарушением переваривания и всасывания жиров. Механизм желчно-каменной болезни.
23.Патология межуточного обмена липидов. Врожденные нарушения обмена: болезни Гоше, Пик-Нимана, Тей-Сакса, ксантоматоз
идр.
89
24.Нарушения, связанные с недостаточным поступлением в организм жирорастворимых витаминов.
25.Витамин D, его влияние на обмен кальция и фосфора. Нарушения минерального обмена при рахите.
РАЗДЕЛ IX. ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ И ПРОСТЫХ БЕЛКОВ.
Занятие № 27
ТЕМА. АЗОТИСТЫЙ БАЛАНС. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЦЕН-НОСТЬ, ПЕРЕВАРИВАНИЕ И ВСАСЫВАНИЕ БЕЛКОВ. ГНИЕНИЕ БЕЛКОВ В КИШЕЧНИКЕ. КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА.
Цель занятия: 1.Знать процессы переваривания и всасывания белков. 2.Изучить процессы гниения аминокислот в кишечнике и обезвреживания продуктов гниения.
3.Овладеть методами количественного и качественного анализа желудочного сока.
Исходный уровень знаний:
-строение и физико-химические свойства аминокислот;
-химия и биологическая роль белков;
-заменимые и незаменимые аминокислоты;
-специфичность действия ферментов.
Содержание занятия.
I.2. Критерии биологической ценности белков. Азотистый баланс: виды, примеры. Физиологический минимум и оптимум белка.
Переваривание и всасывание белков: условия, отделы желудочнокишечного тракта.
Протеолитические ферменты: название, место и механизм активации, субстратная специфичность.
Гниение аминокислот в кишечнике, обезвреживание продуктов гниения.
II.1.Работа № 1. ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТАВНЫЕ ЧАСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА И ИХ ОБНАРУЖЕНИЕ.
Наряду с нормальными компонентами в желудочном соке при ряде заболеваний могут появляться и другие вещества: молочная ки-
90