Praktikum-BH-1

Перемешать и точно через 20 мин измерить оптическую плотность пробы (А1) и эталона (А2) против контрольного раствора при длине волны 500-510 нм, кювета 1 см.

РАСЧЕТ: Количество креатинина (Х) рассчитать по формуле

А1

NB. Определение не совсем специфично, т.к. интерферируют вещества с активной метиленовой группой и некоторые восстанавливающие вещества, напр., глюкоза.

Физиологические значения.

В норме показатель у мужчин составляет 61-115 мкмоль/л,

ВЫВОД:

Работа № 3. ОБНАРУЖЕНИЕ АММОНИЙНЫХ СОЛЕЙ В МОЧЕ.

Принцип метода.

При добавлении в пробирку с мочой раствора слабой щелочи жидкость приобретает запах аммиака вследствие разложения присутствующих в моче аммонийных солей.

2NH4Cl + Ca(OH)2 →2NH4OH + CaCl2

Слабые щелочи типа гидроксида кальция не разлагают азотсодержащие органические вещества (мочевину, креатинин и др.) и разрушают только аммонийные соли.

Порядок выполнения работы.

В пробирку налить 1-2 мл мочи и столько же раствора Ca(OH)2. Опустить в жидкость влажную красную лакмусовую бумажку. Через

101

1-2 мин отметить изменение окраски бумажки. Пробирку можно закрыть ватой.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

III.2. Контрольные вопросы.

Какие продукты азотистого обмена определяются в моче здоровых людей?

Сколько за сутки выделяется креатинина с мочой? Сколько в норме креатинина в сыворотке крови?

Какие цветные реакции используются для определения креати-

нина?

Специфичен ли БИОТЕСТ на креатинин? Почему?

Материал для самоподготовки. а)1 с.451-468, 567-579; II, III

Занятие № 31

КОЛЛОКВИУМ ПО РАЗДЕЛАМ: "ОБМЕН И ФУНКЦИИ АМИНОКИСЛОТ" И "БИОХИМИЯ КРОВИ"

Вопросы к коллоквиуму.

1.Понятие о биологической ценности белков. Заменимые и незаменимые аминокислоты. Нормы белка в питании (потребность в зависимости от возраста). Азотистый баланс.

2.Переваривание белков и всасывание аминокислот в желу- дочно-кишечном тракте. Роль протеиназ поджелудочной железы в развитии панкреатитов (Особенности переваривания и всасывания белков в желудочно-кишечном тракте у детей).

3.Гниение белков (аминокислот) в кишечнике и обезвреживание продуктов гниения.

4.Общая схема источников и путей утилизации аминокислот в тканях. Динамическое состояние белков в организме.

5.Трансаминирование аминокислот: последовательность реак-

ций, роль в обмене веществ. Участие витамина В6 в построении ферментных систем трансаминирования.

102

6.Аминокислоты, участвующие в трансаминировании, особая роль глутаминовой кислоты. Специфичность трансаминаз. Определение трансаминаз в сыворотке крови при некоторых заболеваниях.

7.Распад белков в тканях. Катепсины. Источники азота для синтеза аминокислот.

8.Окислительное дезаминирование аминокислот. Непрямое дезаминирование: последовательность реакций, ферменты, биологическое значение.

9.Особенности дезаминирования серосодержащих и оксиаминокислот. Судьба безазотистого остатка аминокислот в организме. Роль глутаминазы почек при ацидозе.

10.Пути образования и обезвреживания аммиака в организме. Роль глутаминазы почек при ацидозе.

11.Биосинтез мочевины. Последовательность реакций, ферменты. Значение работ М.В.Ненцкого и И.П.Павлова.

12.Суммарное уравнение орнитинового цикла. Нормальная концентрация мочевины в крови. Нарушения синтеза и выделения мочевины. Первичная и вторичная гипераммониемия.

13.Декарбоксилирование аминокислот: химизм реакций на примере отдельных аминокислот.

14.Биогенные амины (гистамин, серотонин, ГАМК), их участие в обмене веществ и развитии патологических состояний. Окисление биогенных аминов. Аминооксидазы.

15.Биосинтез серина и глицина. Их участие в обмене веществ.

16.Роль серина и глицина в образовании одноуглеродных групп. Участие в этом процессе ТГФК. Недостаточность фолиевой кислоты. Механизм бактериостатического действия сульфаниламидов.

17.Синтез цистеина, таурина, глутатиона. Участие их в обмене

веществ.

18.Роль метионина в процессе трансметилирования. Метилирование чужеродных, в том числе лекарственных, соединений.

19.Биосинтез холина, креатина, катехоламинов.

20.Обмен фенилаланина и тирозина: последовательность реакций (образование фумаровой и ацетоуксусной кислот). Физиологическое значение промежуточных метаболитов как источников биологически активных соединений.

21.Биосинтез из предшественников тироксина, меланина. Влияние их на обмен веществ.

22.Обмен триптофана. Биосинтез из предшественников НАД.

23.Гликогенные и кетогенные аминокислоты.

24.Биохимические основы врожденных нарушений обмена от-

103

дельных аминокислот (фенилпировиноградная олигофрения, алкаптонурия, альбинизм, болезнь Хартнупа).

25.Физиологическая роль белков плазмы крови. Белковые фракции, значение отдельных белков.

26.Гиперпротеинемия и гипопротеинемия. Диспротеинемии, парапротеинемии, врожденные дефектопротеинемии.

27.Антигены. Представления об индивидуальных особенностях антигенного состава организма как основа тканевой несовместимости. Иммуноглобулины. Механизм взаимодействия антител с антигеном.

Раковоэмбриональные антигены.

28.Представления о белках свертывания крови и каскаде реакций при свертывании. Механизм образования геля фибрина и его стабилизация. Роль витамина К в свертывании крови.

29.Противосвертывающая система, антитромбин и гепарин. Фибринолиз.

РАЗДЕЛ X. ОБМЕН СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ

Занятие № 32

ТЕМА. ОБМЕН НУКЛЕОПРОТЕИДОВ. БИОСИНТЕЗ И РАСПАД ПУРИНОВЫХ И ПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ.

Цель занятия: 1.Ознакомиться с синтезом пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

2.Знать катаболизм пуринов и пиримидинов. Исходный уровень знаний:

-химия и свойства белков;

-химия нуклеиновых кислот;

-классификация и номенклатура ферментов;

-обмен простых белков.

Содержание занятия.

I.2. Источники пуринового кольца.

Синтез пуриновых нуклеотидов из инозиновой кислоты. Синтез пиримидиновых нуклеотидов.

Распад пуринов до мочевой кислоты. Распад пиримидиновых нуклеотидов.

Распад нуклеиновых кислот в желудочно-кишечном тракте и тканях. Регуляция обмена нуклеотидов.

Патология обмена нуклеопротеидов.

104

II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ.

Мочевая кислота у человека является конечным продуктом обмена пуриновых оснований, входящих в состав сложных белков - нуклеопротеинов.

Принцип метода.

Мочевая кислота способна восстанавливать фосфорновольфрамовый реактив в фосфорно-вольфрамовую синюю, интенсивность окраски которой пропорциональна содержанию мочевой кислоты. При титровании фосфорно-вольфрамовой синей красной кровяной солью К3[Fe(CN)6] она окисляется и синее окрашивание исчезает.

Порядок выполнения работы.

К 1,5 мл мочи прибавить 1 мл 20% раствора карбоната натрия и 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива Фолина, перемешать и титровать 0,01 N раствором красной кровяной соли до исчезновения окраски.

РАСЧЕТ: Содержание мочевой кислоты (в мг) в суточной моче вычисляют по формуле:

0,8 • А • В

0,8 - количество мочевой кислоты в мг, соответствующее 1 мл раствора К3[Fe(CN)6];

А - количество красной кровяной соли, пошедшее на титрование в мл; В - суточный диурез в мл.

Физиологические значения.

В норме у человека с мочой выделяется 1,6-3,54 ммоль/сут (270600 мг/сут) мочевой кислоты.

Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/сут) равен

0,0059.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

105

Клинико-диагностическое значение.

Гипоурикурия отмечается при подагре, нефрите, почечной недостаточности.

Гиперурикурия - при алиментарной (пищевой) лейкемии, усиленном распаде нуклеопротеидов.

У детей выделяется относительно больше мочевой кислоты, чем у взрослых. Выделение мочевой кислоты зависит от содержания пуринов в пище и интенсивности обмена нуклеопротеидов.

Работа № 2. ВЫДЕЛЕНИЕ КАЗЕИНОГЕНА МОЛОКА И ГИДРОЛИЗ ЕГО. (для пед. факультета)

Казеиноген обладает свойствами кислоты и в молоке находится

ввиде анионов, растворимых в воде (кальцинат казеиногена). Недиссоциированные молекулы казеиногена мало растворимы в воде. Изо-

электрическая точка казеиногена соответствуети рН 4,7. Этим объясняется, что при подкислении молоко свертывается в результате выпадения в осадок казеиногена. Свертывание молока возможно и

вприсутствии молочной кислоты, образовавшейся из лактозы под действием молочнокислых бактерий. При ферментативном свертывании молока (действии пепсина) казеиноген подвергается химическим изменениям с образованием из него казеина. Кальциевая соль казеина в противоположность кальциевой соли казеиногена нерастворима в воде.

Порядок выполнения работы.

1.Выделение казеиногена. К 4 мл молока прилить равный объем дистиллированной воды. Осадить казеиноген добавлением двух капель концентрированной уксусной кислоты. Выпавший осадок казеиногена отфильтровать и промыть на фильтре дистиллированной водой 2 раза.

2.Гидролиз казеиногена. При щелочном гидролизе казеиногена происходит его распад на фосфат и белок. После осаждения казеиногена из молока все содержимое с фильтра перенести в пробирку для гидролиза с обратным холодильником. Смыть осадок с фильтра 2 мл 0,1% раствора карбоната натрия в ту же пробирку и добавить 4 мл 10% раствора едкого натра. Кипятить на умеренном огне (на асбестовой сетке) 15 мин с момента закипания. После охлаждения к гидролизату добавить равный объем 0,1% раствора карбоната натрия и провести реакции на продукты гидролиза (обнаружение белка - стр. 9-11; обнаружение фосфата стр.48-49).

106

РЕЗУЛЬТАТ:

III.2. Контрольные вопросы.

Что является исходным субстратом для образования мочевой кислоты?

Какова нормальная суточная экскреция мочевой кислоты с мочой у человека?

Для каких заболеваний характерна гиперурикемия? гипоурике-

мия?

Какие факторы влияют на концентрацию мочевой кислоты в мо-

че?

Что такое подагра?

Есть ли возрастные особенности концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях?

Материал для самоподготовки. а)1 с.469-478, 498-503; II, III

Занятие № 33

ТЕМА. ХИМИЯ И ОБМЕН ХРОМОПРОТЕИДОВ. РОЛЬ ПЕЧЕНИ В ПИГМЕНТНОМ, УГЛЕВОДНОМ, ЛИПИДНОМ И БЕЛКОВОМ ОБМЕНАХ. ДЕТОКСИКАЦИОННАЯ ФУНКЦИЯ ПЕЧЕНИ.

Цель занятия: 1.Повторить особенности строения молекулы гемоглобина.

2.Ознакомиться с синтезом гема.

3.Изучить образование и выведение из организма желчных пигментов.

4.Знать характеристику основных типов желтух. Исходный уровень знаний:

-химия сложных белков;

-классификация ферментов;

-обмен жиров, белков, углеводов;

-обезвреживание ядовитых продуктов гниения аминокислот в кишечнике.

Содержание занятия.

I.2. Строение молекулы гемоглобина; структурные отличия различных типов гемоглобина по глобину, по гему.

107

Синтез гема: место синтеза, химизм до образования порфобилиногена.

Распад гемоглобина в тканях: локализация, химизм превращений до билирубина, дальнейшие превращения и выведение желчных пигментов из организма.

Роль печени в белковом, углеводном, липидном, пигментном обмене. Обезвреживающая функция печени.

Характеристика основных типов желтух.

Обмен железа в организме, роль трансферрина, ферритина, гаптоглобина, гемосидерина.

II.1.Работа № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В КРОВИ.

Билирубин (свободный или непрямой) образуется в процессе распада гемоглобина в тканях ретикулоэндотелиальной системы, костного мозга, печени, селезенки. Затем он транспортируется альбумином крови в печень, где связывается глюкуроновой кислотой при участии фермента глюкуронилтрансферазы, превращаясь в связанный (прямой) билирубин.

Свободный билирубин нерастворим в воде, хорошо растворим в органических растворителях, токсичен, не проходит через почечный фильтр и не выделяется с желчью.

Прямой билирубин менее токсичен, хорошо растворим в воде, проходит через почечный фильтр, секретируется в желчь. В кишечнике билирубин последовательно превращается в мезобилирубин, мезобилиноген (уробилиноген), стеркобилиноген, стеркобилин.

Принцип метода.

Диазореактив дает с прямым билирубином розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина и может быть определена фотометрически.

Непрямой билирубин можно перевести в растворимое состояние добавлением к сыворотке кофеинового реактива и определить с помощью диазореакции. Общая концентрация обеих форм билирубина в сыворотке крови составляет общий билирубин. По разнице между количеством общего и прямого билирубина определяют уровень свободного билирубина.

Порядок выполнения работы.

108

NB! Реактивы к сыворотке сначала добавить в 2 пробирку, а через 8 мин в 1 и в контрольную (тогда экспозиция закончится одновременно).

Оставить пробирки на столе на 10 мин. Затем фотоколориметрировать против контроля в кювете 10 мм при зеленом светофильтре (630 нм). По калибровочному графику, зная оптическую плотность, определить концентрацию прямого и общего билирубина, рассчитать количество непрямого билирубина.

Клинико-диагностическое значение.

В норме содержание общего билирубина составляет 1,7-20,5 мкмоль/л;

непрямого - 1,7-17,1 мкмоль/л; прямого - 0,86-4,3 мкмоль/л.

У новорожденных общего билирубина в норме до 23,17 мкмоль/л.

При физиологической желтухе общий билирубин увеличен, в основном, за счет непрямого вследствие функциональной недостаточности печени.

Определение фракций билирубина имеет большое значение для дифференциальной диагностики различных типов желтух.

Коэффициент пересчета в единицы СИ равен 17,104. РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

Работа № 2. КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖЕЛЧНЫХ ПИГМЕНТОВ В МОЧЕ.

Желчные пигменты появляются в моче в виде щелочных солей при желтухе. Моча, содержащая желчные пигменты, имеет желтоватокоричневое или зеленое окрашивание. Большинство химических проб на желчные пигменты основано на способности билирубина и биливердина легко окисляться с образованием различно окрашенных продуктов: биливердина (зеленого), билицианина (синего), холетелина (желтого) и др.

109

Порядок выполнения работы.

1.Проба Гмелина. К 20 кап. конц. HNO3 в пробирку осторожно наслоить исследуемую мочу так, чтобы жидкости не смешивались. Отметить появление на границе раздела жидкостей различно окрашенных колец. (Первым должно появиться зеленое кольцо).

РЕЗУЛЬТАТ:

2.Проба Розенбаха (видоизменение пробы Гмелина). Профильтровать около 2 мл исследуемой мочи через малень-

кий фильтр. Затем внести 1 кап. азотной кислоты в конце фильтра и наблюдать появление окрашенных колец, как в пробе Гмелина.

РЕЗУЛЬТАТ:

III.2. Контрольные вопросы.

Какова нормальная концентрация общего билирубина и его фракций в крови взрослого человека (новорожденного)?

Какие фракции билирубина Вы знаете?

Чем отличается прямой билирубин от непрямого?

Какой желчный пигмент выделяется в норме с мочой и в каком количестве?

Что понимают под уробилиногеном?

Материал для самоподготовки. а)1 c.503-508, 551-566, 577, 584.

II, III

РАЗДЕЛ XI. РЕГУЛЯЦИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ. ИЕРАРХИЯ РЕГУЛЯТОРНОЙ СИСТЕМЫ

Занятие № 33

ТЕМА. ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ. ПУТИ ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ НА КЛЕТОЧНОМ И МЕЖОРГАННОМ УРОВНЯХ.

Цель занятия: 1. Ознакомиться с классификацией гормонов. 2.Изучить роль отдельных гормонов в регуляции обмена ве-

ществ.

3.Овладеть методами качественного определения некоторых гормонов.

Исходный уровень знаний:

110