Какими свойствами должен обладать экспрессионный бактериальный штамм для успешной экспрессии генов белков?
Происхождение большинства лабораторных и промышленных штаммов E. coli восходит к штамму линии K-12 или к штамму линии B. Особенностью этих штаммов является наличие мутаций, которые обеспечивают высокий выход и качество экспрессируемых плазмид.
Бактерии штаммов B предпочтительны для производства рекомбинантных белков ввиду нескольких ключевых свойств. Штаммы этой линии не обладают жгутиками, тем самым сохраняя клеточные ресурсы, что выражается в лучших ростовых свойствах и большем выходе биомассы клеток. Клетки этой линии лучше усваивают глюкозу из среды, при культивировании образуют меньше уксусной кислоты, даже при высокой концентрации глюкозы в среде. Кроме того, штаммы B, по сравнению с K-12, эффективнее секретируют белки в периплазматическое пространство. В клетках E. coli линии B биосинтез аминокислот проходит активнее, клетки обладают дополнительной системой секреции II типа, отличаются строением наружной мембраны и клеточной стенки. Больший выход рекомбинантных белков также обусловлен меньшей деградацией экспрессируемых белков во время выделения и очистки ввиду меньшего содержания протеолитических ферментов.
Для повышения уровня экспрессии рекомбинантных белков необходимо обеспечить стабильность плазмидного вектора, стабильность, эффективность транскрипции и трансляции мРНК целевого гена, устойчивость транслированного полипептида, корректный фолдинг экспрессируемого белка.
Какие вещества и в каких случаях используют для регуляции экспрессии гена целевого белка в бактериальных экспрессионных системах?
С lac-опероном связываются репрессоры в отсутствии лактозы. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.
Многие
промоторы,
особенно промоторы оперонов с генами,
кодирующими белки метаболизма сахаров,
регулируются как отрицательно, так и
положительно. Подобный двойной контроль
характерен, например, для lac-промотора
оперона кишечной палочки, контролирующего
экспрессию белков метаболизма лактозы.
Репрессорный белок LacI связывается после
lac-промотора при отсутствии лактозы и
ингибирует транскрипцию генов lacZYA. В
присутствии аллолактозы, которая
синтезируется из лактозы ферментом
бета-галактозидазой, или в присутствии
негидролизуемого синтетического аналога
(ИПТГ) белок-репрессор теряет аффинность
к оператору. Ввиду того, что ИПТГ не
подвержена гидролизу ферментами клетки
E. coli, для индукции требуется меньшая
концентрация этого вещества по сравнению
с лактозой.
Триптофановый промотор является сильным промотором, при индукции экспрессии уровень транскрипции гена повышается примерно в 70 раз, и содержание рекомбинантного белка может составлять до 30 % всех белков клетки. В отличие от lac-промотора, trp-промотор контролирует экспрессию анаболических ферментов метаболизма триптофана − белков, катализирующих биосинтез триптофана. Когда содержание триптофана высоко, клетка не нуждается в его биосинтезе, и промотор репрессируется. L-арабиноза может использоваться клетками кишечной палочки в качестве единственного источника углерода.
Арабинозный оперон регулируется наличием или отсутствием глюкозы. низкий уровень глюкозы повышает уровень экспрессии, а высокий понижает. Это потому, что арабиноза может использоваться клетками кишечной палочки в качестве единственного источника углерода