Лабораторная работа № 2. Изучение законов затухания люминесценции

Целью работы является изучение методов измерения законов затухания люминесценции.

Задание:

1. Изучить методы измерения длительностей и законов затухания люминесценции (см. ниже раздел "Методические рекомендации").

2. Изучить установку для измерения кинетики флуоресценции в наносекундном диапазоне (см. прилагаемое описание).

3. Приготовить раствор родамина 6Ж в этиловом спирте.

4. Выбрать длину волны возбуждения и длину волны, на которой будет регистрироваться кинетика затухания люминесценции для предложенного образца (раствора).

5. Провести измерение аппаратной функции прибора, используя рассеивающий объект и осуществляя регистрацию кинетики на длине волны возбуждающего излучения.

6. Провести измерение свертки аппаратной функции прибор и кинетики затухания люминесценции.

7. Рассчитать длительность затухания образца.

8. Проанализировать возможные источники погрешностей при измерениях и обработке результатов.

Методические рекомендации

Методы измерения законов и длительностей затухания люминесценции .

Очевидно, что для измерения закона затухания необходимо коротким световым импульсом перевести часть молекул в возбужденное состояние, а затем зарегистрировать изменение интенсивности люминесценции по времени.

Временное разрешение метода определяется длительностью возбуждающего импульса t и временным разрешением системы регистрации. Проиллюстрируем это на примере регистрации кинетики затухания свечения (например, люминесценции). Пусть I(t) — истинный закон затухания свечения. Если возбуждение осуществляется импульсом света с временным профилем, задаваемым функцией a(t), то временной профиль интенсивности света, излучаемого системой I_изл(t) опишется сверткой вида:

. (2.1)

Импульс I_изл(t) поступает на фотоприемник (например, ФЭУ), сигнал на выходе которого I_рег(t) также будет представлять собой свертку I_изл(t) с функцией b(t), описывающей временной отклик фотоприемника. (Эту функцию можно получить, регистрируя сигнал с фотоприемника, получающийся при поступлении на него "–импульса" света с длительностью t  t_b, где t_b — ширина функции b(t)). Таким образом,

. (2.2)

Если t_b, а также ширина t_a возбуждающего импульса a(t) значительно меньше характерной длительности затухания свечения , то I_рег(t) = const I(t), т.е. форма зарегистрированного сигнала совпадает с формой истинного закона затухания. Если же t_a и/или t_b сопоставимы с , для извлечения из I_рег(t) истинного закона затухания требуется решать задачу деконволюции, т.е., нахождения из интегральных уравнений (2.1), (2.2) истинного вида I(t). Такого рода задачи относятся к классу т.н. некорректных, решение может оказываться неустойчивым к ошибкам измерения I_рег(t), a(t), b(t). Несмотря на то, что в настоящее время имеются достаточно эффективные алгоритмы решения задач деконволюции, очевидно, что надежное восстановление вида I(t) возможно только в тех случаях, когда t_a и t_b по крайней мере не слишком велики в сравнении с . Таким образом, для проведения исследований кинетики быстрых процессов необходимо как использование источников света с достаточно короткими длительностями импульсов, так и систем регистрации с малым временем отклика.

Исторически первыми были экспериментальные установки, в которых выделение возбуждающего импульса из света от непрерывного источника, как и выделение временных интервалов (где производилась регистрация люминесценции), осуществлялось с помощью механических затворов (чаще всего вращающихся дисков с прорезями). Естественно, с использованием такого рода систем трудно измерять времена затухания меньше 10^-4 с.

Для измерений времен затухания в милли- и микросекундном диапазонах обычно используются установки, в которых источником возбуждения служит импульсная лампа с длительностью импульса 1 мкс, а сигнал люминесценции с фотоумножителя подается на вход запоминающего осциллографа, на экране которого за одну вспышку лампы получается полная кривая затухания.

Времена затухания флуоресценции сложных молекул обычно лежат в наносекундном диапазоне. Для их измерения разработан ряд методов. Так, при измерениях на т.н. фазовом флуорометре время затухания определяется по сдвигу фаз между синусоидально промодулированным возбуждающим световым потоком и сигналом люминесценции. Можно показать (путем непосредственного вычисления свертки), что в случае гармонической модуляции и экспоненциального затухания сигнал люминесценции будет строго синусоидальным, но сдвинутым по фазе тем значительнее, чем больше . Время затухания определяют из соотношения

. (2.3)

Частота модуляции должна быть порядка 10⁷ + 10⁸ Гц. Однако в случае неэкспоненциального затухания результаты, полученные фазовым методом, интерпретировать затруднительно. В связи с этим получили распространение импульсные методы, позволяющие непосредственно получать кинетику затухания. Так, в некоторых установках флуоресценция возбуждается интенсивным коротким лазерным импульсом длительностью порядка 1 ÷ 5 нс. В качестве фотоприемников применяются специальные фотоумножители с улучшенными временными характеристиками (т.е. обеспечивающие минимальный разброс времен пролета электронов, образовавшихся вследствие первичной фотоэмиссии и вторичной эмиссии с динодов). Регистрация осуществляется при помощи стробоскопического осциллографа (для получения кривой затухания необходимо произвести достаточно большое число вспышек).

О дним из наиболее совершенных и широко применяемых методов флуоресцентной спектроскопии, обеспечивающим наносекундное (и даже субнаносекундное) временное разрешение, является статистический одноквантовый метод, фигурирующий также в литературе под названием метод время-коррелированного счета фотонов (time-correlated single photon counting). Именно этот метод используется в настоящей лабораторной работе.

Схема установки для реализации статистического одноквантового метода приведена на рис. 2.1. Возбуждение объекта осуществляется излучением импульсной лампы (или лазера) с в ысокой частотой следования импульсов (10³ – 10⁵ Гц). Принципиальным моментом метода является то, что интенсивность возбуждения ослабляется до такого уровня, при котором с фотоприемника (ФЭУ 1), регистрирующего сигнал флуоресценции, от одного импульса возбуждения регистрируется не более одного импульса фототока (одноэлектронного импульса). Именно в связи с этим требуется высокая частота следования возбуждающих импульсов, позволяющая накопить достаточно большой набор импульсов с ФЭУ за приемлемое время эксперимента. Стартовый сигнал, необходим для привязки начала (нуля) временной оси, регистрируется антенной, расположенной вблизи разрядного промежутка импульсной лампы. Сигналы с антенны и ФЭУ усиливаются, формируются к стандартному виду и подаются соответственно на входы "Старт" и "Стоп" преобразователя "время – амплитуда" (ВАП). По приходе импульса на вход "Старт" ВАП формирует на выходе линейно нарастающее со временем напряжение (см. рис. 2.2). Пришедший через некоторое время t_i на вход "Стоп" сформированный одноэлектронный импульс от ФЭУ обрывает нарастание напряжения на выходе ВАП. Таким образом, на выходе ВАП формируется импульс с амплитудой U_i  t_i, т.е. времени между приходом возбуждающего импульса и появлением фотона флуоресценции. Импульсы с ВАП поступают в многоканальный амплитудный анализатор (МАА), в каналах (ячейках памяти) которого по многим импульсам лазера накапливается распределение импульсов по амплитудам. Вследствие пропорциональности U_i  t_i это распределение адекватно отражает распределение фотонов флуоресценции на оси времени, т.е., кинетику затухания флуоресценции. Если от вспышки лампы в течение некоторого наперед заданного времени (существенно превышающего время затухания флуоресценции) на вход "Стоп" ВАП не пришел импульс от ФЭУ, электронная схема ВАП аннулирует сформированный сигнал и не передает его в МАА. В случае же, когда от одного импульса лампы с ФЭУ в ВАП поступает два (или более) одноэлектронных импульса, то будет иметь место искажение накапливаемой в МАА кинетики затухания. Действительно, первый из поступивших импульсов остановит рост формируемого в ВАП напряжения; второй же импульс, прибывший позднее, будет проигнорирован, т.к. быстродействие схемы ВАП не позволяет привести устройство в состояние готовности за времена, измеряемые наносекундами. (Интервал между последовательными парами "Старт – Стоп", обрабатываемыми ВАП, в нормальном режиме работы составляет величину f ^–1 , что при частоте следования f = 10⁵ Гц дает 10 мкс — достаточно большое время, не налагающее жестких требований на быстродействие электронной схемы ВАП). То обстоятельство, что второй из одноэлектронных импульсов не будет учтен в регистрируемом МАА распределении, с неизбежностью ведет к искажению кинетики (искусственно занижается число импульсов, отвечающих большим временам затухания). Именно этим мотивировано требование прихода с ФЭУ не более одного импульса от одной вспышки источника.

Ш ирина аппаратной функции описанного выше наносекундного флуорометра определяется сверткой временного профиля возбуждающего импульса с аппаратной функцией системы регистрации. Ширина последней, на первый взгляд, может быть отождествлена с шириной t_одноэл одноэлектронного импульса, формирующегося на выходе ФЭУ (в обычно выполняющемся предположении о том, что уширением этого импульса в усилителе и других электронных элементах можно пренебречь). Реальная ситуация, однако, существенно благоприятнее. Дело в том, что время прихода одноэлектронного импульса на вход "Стоп" ВАП может быть определено с более высокой точностью, чем ширина одноэлектронного импульса. Например, из одноэлектронного импульса может быть сформирован сигнал в виде производной, а схема временной привязки запуска стопового сигнала в ВАП построена таким образом, что срабатывает в момент обращения сигнала производной в ноль, т.е., по максимуму одноэлектронного импульса. На практике оказывается, что при достаточно совершенных схемах временной привязки, можно осуществлять ее с точностью порядка 0,1t_одноэл и даже выше. Наиболее существенным фактором, определяющим ширину аппаратной функции системы регистрации при использовании в качестве фотоприемника ФЭУ, является т.н. разброс пролетных времен. Он проявляется в том, что появляющиеся на выходе ФЭУ одноэлектронные импульсы имеют определенное распределение временных задержек относительно момента прихода фотона на фотокатод. Причиной этого разброса времен появления выходных одноэлектронных импульсов является различие в скоростях электронов при их выходе с фотокатода, что приводит к разбросу времен прохождения ими промежутка между фотокатодом и первым динодом. (За счет более высоких скоростей электронов в других междинодных промежутках дополнительным разбросом времен пролета в динодной системе можно пренебречь). С учетом сделанных замечаний в зависимости от типа ФЭУ можно получить ширину аппаратной функции системы регистрации от 1 нс (обычные ФЭУ) до 100 – 200 пс (ФЭУ со специальной конструкцией электродной системы, а также микроканальные ФЭУ). С использованием в качестве фотоприемников лавинных фотодиодов можно уменьшить ширину аппаратной функции до десятков пикосекунд.

Таким образом, статистический одноквантовый метод может использоваться для исследования не только наносекундных, но и субнаносекундных процессов. (Очевидно, что лазерный источник в последнем случае должен обеспечивать также субнаносекундную длительность импульсов).

Следует также отметить высокую чувствительность, достигаемую с применением статистического одноквантового метода. Действительно, в процессе регистрации фотонов флуоресценции не используется принцип "временного окна", за пределами которого фотоны флуоресценции не регистрируются; в данном методе каждый одноэлектронный импульс привязывается к временной оси. Существенным является также большой динамический диапазон измеряемых интенсивностей в пределах кинетики затухания, обеспечиваемый методом. Так, если в результате накопления кинетики в первых каналах МВА, соответствующих малым временам после импульса возбуждения, накоплено, например, порядка 10⁷ импульсов, то в предположении экспоненциального затухания через время, например, равное 7 в каналах будет в e⁷  1000 раз меньше отсчетов, т.е. порядка N = 10⁴ импульсов. Такое число отсчетов обеспечивает достаточно малую, на уровне 1%, статистическую ошибку в измеренном сигнале (N^-1/2 = 0,01). В результате кинетика затухания может быть измерена с высокой точностью вплоть до поздних этапов затухания, что обеспечивает возможность детального анализа сложных неэкспоненциальных кинетик.

Определенным недостатком статистического одноквантового метода является большое время накопления сигнала, требующееся для получения достаточной статистики отсчетов в каналах. Следует учесть, что в обсуждаемом здесь одноквантовом методе для обеспечения пренебрежимо малой вероятности появления двух или более одноэлектронных импульсов за одну вспышку возбуждения, среднее число импульсов фототока m должно быть существенно меньше одного. Используя распределение Пуассона, описывающее в обсуждаемом здесь случае вероятность w(n) появления n импульсов при среднем значении (математическом ожидании) m :

w(n) = (mⁿ/n!)e^–m; (2.4)

получим, что при m = 0,1 вероятность появления двух импульсов в 20 раз ниже, чем одного. Т.е., интенсивность, отвечающая m = 0,1, может считаться приемлемой для обеспечения одноквантового режима. Оценим время, требующееся для накопления кривой затухания. Итак, за N вспышек источника (N = fT, где T — общее время измерения) имеем интегральную по времени интенсивность сигнала mN. Если закон затухания экспоненциальный, т.е. I(t) = I₀ exp(–t/), то

, (2.5)

откуда получаем интенсивность (число отсчетов) в i-м канале с ценой t:

I(t_i) = (mfT/)t exp(–t_i/). (2.6)

Таким образом, имея из (2.6) для нулевого момента времени имеем

T = I(0)/tmf. (2.7)

Получаем для I(0) = 10⁶, m = 0,1, f = 10⁵ Гц и t = 0,01 время набора кинетики T = 10⁴ с. Очевидно, что для уменьшения времени набора следует либо повышать частоту f, либо снижать требования к уровню точности в регистрируемой кинетике, т.е., уменьшать I(0).

Контрольные вопросы

1. Как можно приближенно оценить время жизни флуоресценции молекулы, не прибегая к его непосредственным измерениям?

2. Почему время затухания фосфоресценции существенно больше времени затухания флуоресценции?

3. Почему время затухания термически активированной замедленной флуоресценции равно времени жизни триплетного состояния?

4. Приведите выражение, связывающее время затухания с вероятностями излучательных и безызлучательных переходов.

5. Приведите возможно большее число примеров систем, для которых затухание люминесценции является неэкспоненциальным.

6. Укажите причины, по которым измеряемая в эксперименте кинетика затухания люминесценции по форме может отличаться от истинной.

7. Укажите и разъясните преимущества статистического одноквантового метода в сравнении с известными вам другими методами измерения кинетики (или времени) затухания флуоресценции в наносекундном диапазоне.

8. Почему в статистическом одноквантовом методе требуется снижение интенсивности сигнала до уровня, обеспечивающего появление в системе регистрации не более одного импульса от одной вспышки возбуждающего источника?

9. В чем заключаются ограничения метода фазовой флуорометрии?

10 Что представляет собой регистрируемая в настоящей работе аппаратная функция установки?

11. Что является фактором, лимитирующим временное разрешение используемой в настоящей работе установки?