- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Физико-химические механизмы ферментативного катализа
Структурные особенности поверхностного слоя белковых глобул позволяют сосредоточить в активном центре большое число различных по химической природе функциональных групп, способных не только сорбировать молекулу субстрата, но также и взаимодействовать с ней химически. Среда активного центра обладает высокоразвитой микрогетерогенностью, где гидрофобные участки с исключительно низкой диэлектрической проницаемостью и полярностью (по сравнению с водой) чередуются с сильно гидратированными полярными областями с высоким электростатическим потенциалом и т. д.. Поверхностный слой характеризуется также и повышенной микровязкостью. Все эти эффекты способствуют в конечном итоге многоцентровому взаимодействию фермента (его активного центра) с молекулой субстрата (хелатные или клешневидные комплексы).
Наиболее существенными представляются три причины ускорений ферментативных реакций (по сравнению с гомогенно-каталитическими процессами):
1) сорбционные взаимодействия с белком боковых субстратных групп обеспечивают ускорение реакции порядка 107 раз и более;
2) полифункциональный катализ (типа общего кислотно-основного катализа) вполне может привести к ускорениям, превышающим величину 103;
3) весьма существенное влияние на ферментативную реакцию (изменение скоростей на несколько десятичных порядков) могут оказать также и эффекты микросреды активного центра.
В целом на основании этих физико-химических механизмов можно ожидать cуммарных эффектов ускорения более чем в 1010 раз. Как видно, это вполне покрывает тот масштаб ускорений, который отличает ферментативный катализ от механизмов гомогенно-каталитического типа.
Таким образом, успехи современной теории биологического катализа и теоретической химии показали, что ферментативные реакции при всей их сложности протекают в полном соответствии с общими закономерностями обычных химических превращений. Объяснение огромных преимуществ, которыми ферментативный катализ отличается от небиологического гетеро- и гомогенного катализа, заложено фактически лишь в исключительно сложной структуре макромолекул белка.
Лекция 3.2
Механизм действия гидролаз
на примере карбоксипептидазы А
Деление гидролаз на типы
по механизму действия и строению активного центра
Гидролазы – это третий класс ферментов. Сюда относятся многие ферменты, имеющие промышленное значение, и большинство пищеварительных ферментов. Общим свойством всех гидролаз является то, что они катализируют реакции гидролиза, то есть расщепление более сложных соединений на более простые с присоединением воды. К классу гидролаз относятся также протеолитические ферменты (подкласс 3.4), катализирующие гидролиз пептидов и белков и имеющие большое значение в теоретической энзимологии и в практике применения ферментных препаратов. Согласно современной номенклатуре и классификации ферментов, протеолитические ферменты принадлежат к подклассу пептидаз – гидролаз и по механизму действия делятся на 4 типа:
1. Аминопептидазы (3.4.1; α-аминоацилпептид – гидролазы). Отличительной чертой этих ферментов является то, что для их действия необходимо наличие в молекуле субстрата свободной α-аминной группы (например, лейцинаминопептидаза, аминотрипептидаза и др.);
2. Карбоксипептидазы (3.4.2; пептидил-аминокислотные гидролазы). Как показывает само название, для действия фермента необходимо наличие в молекуле субстрата свободной карбоксильной группы (например, карбоксипептидаз А, карбоксипептидаза В и др.);
3. Дипептидазы (3.4.3; дипептид – гидролазы). Согласно современным данным, существование дипептидаз, действующих на многие дипептиды, кажется весьма сомнительным. В то же время в различных объектах обнаружены дипептидазы с весьма высокой специфичностью. Таковы, например, глицилглицин-дипептидаза, иминодипептидаза, имидодипептидаза.
4. Протеиназы (3.4.4; пептидил-пептид – гидролазы). Сюда относятся ферменты, составляющие по классификации М. Бергманна группу эндопептидаз. Эндонептидазы, в отличие от экзопептидаз, способны гидролизовать не только концевые пептидные связи, но и связи, расположенные внутри белковых молекул. В эту группу входит ряд хорошо изученных ферментов, имеющих большое практическое значение (например, пепсин, трипсин идр.).
Многие протеолитические ферменты образуются в виде «зимогенов» – неактивных предшественников. Таковы пепсин, реннин, химотрипсин, трипсин, тромбин, карбоксипептидаза. За последние годы достигнуты большие успехи в изучении процесса активации – превращения предшественников (зимогенов) в активные ферменты. Установлено, что в основе процесса активации лежит так называемый ограниченный протеолиз (см. лекцию 4.1).
Синтез протеиназ в неактивной форме и ряда других неактивных белков-предшественников имеет, очевидно, определенный биологический смысл, предотвращая разрушение клеток органов, в которых образуются проферменты. Примерами подобного активирования белков является активирование некоторых гормонов (проинсулин → инсулин), белка соединительной ткани (растворимый проколлаген → в нерастворимый коллаген), белков свертывающей системы крови.
Большой интерес представляет строение активного центра протеолитических ферментов. В зависимости от строения активного центра протеолитические ферменты можно разделить на три группы. Первая группа включает ферменты, не требующие присутствия активаторов; сюда относятся трипсин, химотрипсин, пепсин. Вторая группа включает энзимы, которые требуют активации такими веществами, как цистеин, глютатион, аскорбиновая кислота, цианид; сюда относятся некоторые катепсины, папаин, фицин. Третью группу составляют энзимы – металлопротеины. Активность этихферментов сильно увеличивается в присутствии ионов металллов, таких, как Mn2+, Mg2+, Zn2+, Со2+ и др. Первая группа протеаз может быть разделена на две подгруппы. К первой подгруппе относятся ферменты, действующие в кислой зоне рН (пепсин, реннин) о строении их активных центров известно сравнительно немного. Есть данные, что для каталитического действия пепсина большое значение имеют остатки тирозина и аспарагиновой кислоты. Ко второй подгруппе относятся ферменты, имеющие оптимум рН в щелочной зоне и составляющие группу так называемых «сериновых» протеаз (трипсин, химотрипсин, тромбин, панкреатопептидаза Е, субтилопептидаза).