- •Глава1.
- •Частьii.Собственныеисследования
- •Глава2. Материалыиметоды…………………………………………502.1.Общаяхарактеристикабольных……………………………………………50
- •Глава3.Результатыисследования………………………………...74
- •Глава4.Обсуждениеполученныхрезультатов…………. 221
- •Списоксокращений
- •Введение Актуальностьпроблемы
- •Научнаяновизнаисследования
- •Практическаязначимость
- •Основныеположения,выносимыеназащиту
- •Внедрениерезультатов работывпрактическоездравоохранение
- •Апробацияработы
- •ГлаваI обзорлитературы
- •ЭтиологияипатогенезИап
- •Классификация,клиническиеособенности иап
- •Пузырчаткавульгарная(Pemphigusvulgaris)
- •Пузырчаткалистовидная(эксфолиативная) /Pemphigusfoliaceus/
- •Паранеопластическаяпузырчатка(Paraneoplasticpemphigus)
- •1.5.1Общиепредставленияомолекулярной фармакологииСгк
- •СтроениеГр:
- •ИзоформыГр:
- •ЛечениебольныхИап
- •АдьювантнаятерапиябольныхИап
- •Азатиоприн
- •ЦиклоспоринA
- •Метотрексат
- •МофетилМикофенолат
- •Циклофосфамид
- •Никотинамидитетрациклин
- •Соли золота
- •Внутривенный иммуноглобулин
- •Пиридостигминабромид
- •Стероиднаярезистентность
- •Механизмы стероидной резистентности на рецепторномуровне
- •Механизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровне
- •ЧастьIi.Собственныеисследования
- •Глава2.Материалыиметодыисследования
- •Общаяхарактеристикабольных
- •Характеристика больных иап, находившихся поднепосредственнымнаблюдением
- •ИзучениекатамнестическихданныхбольныхИап
- •2.1.3. Изучение клинических данных больных для определениямолекулярныхмеханизмовстероиднойрезистентности
- •МужчиныЖенщины
- •В%соотношении
- •Оборудование
- •Изучениехарактерасвязываниясмембраннымирецепторамипо
- •Исследование связывания меченого сгк внутриклеточными
- •Полимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени
- •Описаниеметода:
- •Исследование молекулярных механизмов стероиднойрезистентности напострецепторномуровне
- •Реактивы
- •Оборудование
- •Приготовлениереактивов
- •Полимеразно-цепнаяреакция
- •Определениефакторанекрозаопухолиα (tnf-α)
- •Радиоизотопныйметод
- •Постановкарадиоизотопногометода
- •Жидкостнаясцинтилляционнаярадиометрия
- •Статистическаяобработкарезультатовисследования
- •Глава3.Результатыисследования
- •Ретроспективный анализисторийболезнибольныхИап
- •Общая характеристикаклиническихданныхбольныхИап
- •Количествобольныхв%соотношении
- •% Отр. 52 Положит. 48 46
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •Нетадювантнойтерапии
- •Такимобразом:
- •3.1.2. ХарактеристикастероидчувствительныхбольныхИап
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 60%
- •КоличествоСр(-)больныхИап в%соотношении
- •% Отр. 58 Положит. 42 0
- •КоличествоСр(-)больных иаПв%соотношении 80%
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 100%
- •Такимобразом:
- •3.1.3.ХарактеристикастероидрезистентныхбольныхИап
- •%Соотношении
- •В%соотношении
- •Онкология
- •Такимобразом:
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 60%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении 100%
- •КоличествобольныхИаПв% соотношении
- •КоличествоСр(-)больныхИаПв %соотношении 80%
- •Такимобразом:
- •Молекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинарецепторномуровнеубольныхистиннойакантолитическойпузырчаткой
- •ИзучениеуровняэкспрессиимРнКα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Бетарецептор альфарецептор
- •3.2.2АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениинауровнеα-иβ-изоформглюкокортикоидныхрецепторов
- •3.2.3.Изучениеколичествамембранныхивнутриклеточныхрецепторовустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольных
- •10*3/Клетку
- •10*3/Клетку
- •3.2.4АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениимембранныхивнутриклеточныхрецепторов
- •МолекулярныемеханизмыстероиднойрезистентностинапострецепторномуровнеубольныхИап
- •ИзучениевключениямеченогоуридинавРнКлимфоцитовпериферическойкровиустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИап
- •Количествовключенногоуридинав
- •Значимыйпоказатель
- •АнализклиническихданныхбольныхИаПприизменениивключения ³н-уридина
- •3.4.РазработкалечениябольныхИаПазатиоприномпристероиднойрезистентности
- •3.4.1Клиническиеданныеприпримененииазатиоприна
- •MaxдозаСгк
- •2 Раза
- •ДинамикакожныхвысыпанийубольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •Осложнения,возникшиеустероидрезистентныхбольныхИаПприлеченииазатиоприномвсочетаниисСгк
- •ИзучениеэкспрессиигенаNf-kBустероидрезистентныхистероидчувствительныхбольныхИаПиеединамикинафонетерапииазатиоприном
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессииGapdhв% 90
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNFkB относительногеновэкспрессии
- •Интервалзначений
- •ЭкспрессиягенаNf-kBотносительно экспрессиигеновGapdhв% 90
- •АнализклиническихданныхстероидрезистентныхбольныхИап приизмененииэкспрессиигенаNf-kBнафонетерапииазатиоприном
- •Определениефакторанекрозаопухолиα(tnf-α)убольныхИап
- •Клиническиепримеры больныхИап
- •Патологоанатомический диагноз.Комбинированноеосновноезаболевание.
- •Проведены обследования:
- •60 Преднизолона
- •Преднизолон Метипред
- •Длительностьприемапрепарата
- •Былпроведенонкопоиск:
- •Заключительный клинический диагноз:
- •Глава4.Обсуждение полученных результатов
- •Практическиерекомендации
- •Библиография
Полимеразно-цепнаяреакция
МетодомсравнительнойоценкиэкспрессиитранскрипционногофактораNF-kBпослужилаполимеразно-цепнаяреакцияврежимереальноговремени.Преимуществоммолекулярно-генетическогометодаявляетсявысокаяскоростьполучениярезультата,атакжевысокаячувствительность(доодноймолекулы)испецифичность.Объединениеэтаповамплификацииидетекциирезультатовснижаетрискконтаминациииошибокприанализерезультатов,появляетсявозможностьоценитькинетикупроцесса,котораязависитотначальногоколичестваисследуемогоматериала.
Материаломисследованияявляласьвенознаякровь,взятаяуэтихпациентов,изкоторойбыливыделенылимфоциты.
ВыделениеРНКизлимфоцитовпроводилиспомощьюнабораРИБО-
ПРЕБ.
Раствордлялизисапрогревалипри65ºСдополногорастворениякристаллов.
Встерильныеодноразовыепробиркивносиликлеточнуюсуспензию,затемцентрифугировали3минпри3тыс.об/мин.Надосадочнуюжидкостьсливалиспомощьюмикропипетки.Добавляливпробиркипо300мклрастворадлялизиса.Промаркировывалипробирки.
Содержимоепробирокперемешивалинавортексе(«МicrospinFV-2400»,фирма изготовитель-«Biosan», Россия)ипрогревали5минпри65ºСвтермостате(«Гном»,фирмаизготовитель–«ДНКтехнология»,Россия).
Добавляливпробиркипо400мклрастворадляпреципетации,перемешивалинамикроцентрифуге“Vortex”.
Центрифугировалипробиркинамикроцентрифуге(«Minispin»,фирмаизготовитель-«Eppendorf», Россия)5минпри13тыс.об/мин.
Аккуратноотбиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникнамикропипеткудлякаждойпробы.
Добавляливпробиркипо500мклрастворадляотмывки3,плотнозакрываликрышки,осторожнопромывалиосадок,переворачиваяпробирки3-5раз.
Центрифугировалипробиркипри13тыс.об/минвтечение2миннамикроцентрифуге.
Аккуратноотобиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникнамикропипеткудлякаждойпробы.
Добавляливпробиркипо200мклрастворадляотмывки4,плотнозакрываликрышки,осторожнопромывалиосадок,переворачиваяпробирки3-5раз.
Центрифугировалипри13тыс.об/минвтечении2миннамикроцентрифуге.
Осторожноотобиралинадосадочнуюжидкость,незадеваяосадок,используяотдельныйнаконечникна10мклдлякаждойпробы.
Помещалипробиркивтермостатпритемпературе65ºСна2миндляподсушиванияосадка-приэтомкрышкипробирокдолжныбылибытьоткрыты.
Добавляливпробиркипо50мклРНК-буфера.Перемешивалинавортексе.Помещаливтермостатпри65ºСна5мин,периодическивстряхиваянавортексе.Центрифугировалипри13тыс.об/минвтечении1миннамикроцентрифуге.НадосадочнаяжидкостьсодержалаочищенныеРНКиДНК(отобираливчистыемикропробирки).Такимобразом,пробыбылиготовыкпостановкереакцииобратнойтранскрипциииПЦР.
ОчищеннаяРНК,ДНКможетхранитьсядо24часовпритемпературеот2до8часов притемпературеневышеминус16ºС.
ПолученнуютотальнуюРНКденатурировали,приэтомобразовываласьодноцепочечнаяРНК.Затемпритемпературе70°Свтечение5минпроводилиотжиг(гибридизацию)праймеров,инкубируямРНКобразца(20мкл),эквимолярнуюсмесь4-хнуклеотидов(8мкл)ипраймеры-гексамеры(1мкл),доводилиобъемсмесиводойдо50мкл.Наэтомэтапепраймеры
«находят»комплементарныеучасткивисследуемойРНКигибридизуютсясними.Затемпроводилиреакциюобратнойтранскрипции.
Комплектреагентов«РЕВЕРТА-L»дляпроведенияреакцииобратнойтранскрипции(«AmpliSensbiotechnologies»,Россия).ВсоставнаборавходитRT-G-mix-1, RT-mix, ревертаза (MMlv), ДНК-буфер.
Приготовлениесмесина22реакций:
-215мклсмеси«микс»,
-25 мклхлоридамагния,
готовую реакционнуюсмесьразливалипо10мклвэппендорфы,
вэппендорфысготовойсмесьюдобавлялипо10мклвыделеннойРНК,
ставилипробиркивтермостат(«Гном»,фирмаизготовитель–«ДНКтехнология»,Россия)стемпературой37ºСна30минут.
Далее сполученнойкДНКпроводилиреакцию обратнойтранскрипции.
ДляпостановкиРТ-ПЦРиспользовали«НаборреактивовдляпроведенияРТ-ПЦРвприсутствииинтеркалирующегокрасителяSYBRGreenI»(«Синтол»,Россия)содержаший:реакционнуюсмесь(ПЦРбуферВ-KCl,ТрисHCl(рН8,8),6,25мМMgCl2;TaqДНК-полимераза;дезоксинуклеозидфосфаты;глицерол,Tween20,интеркалирующийкраситель SYBRGreenI),25мМMgCl2,деонизированную воду.
Таблица10.Постановкареакции.
|
На1пробу,мкл |
На28проб,мкл |
SYBRGreenI |
19 |
532 |
кДНК |
2 |
56 |
Праймер-микс (концентрацияforиrev5пмоль/мкл) |
4 |
112 |
Использовалисьследующиеэкспериментальныепротоколы:95°С-2мин–первичнаяденатурация.
90°С-30сек–денатурация.60°С-20сек–отжиг.
72°С-15сек-элонгация.
40циклов.
Использовалисьследующиепраймеры:
Gapdh:FW5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′RV5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′NF-кВ/RelA:FW5′-TGATCCACATGGAATCGAGA-3′RV5′CAGGAAGGGATATGGAAGCA3.
РТ-ПЦРпроводилинаприбореIQ5Cyclerфирмы«Biorad»,позволяющемнаблюдатьизменениеуровняфлуоресценциивреакционнойсмесивтечениеходареакцииитакимобразомотслеживатьдинамикунакопленияампликонов.
УровеньмРНКанализируемогогенавыравнивалипоотношениюкусредненнымданнымамплификациигеновнеизменногоуровняэкспрессии(housekeepinggenes,геныдомашнегохозяйства)GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа).Прииспользованиивыбраннойматематическоймоделианализанеобходимоопределениефлуоресценциив«threshold»точке(Сt-значениепороговогоцикла)дляданногогена. СPопределяласькакточка,гдеподъемкривойфлуоресценцииампликоновисследуемогогеназначительновыше,чемфоновоесвечение.Количественнаяоценкавсегдаосуществляласьв
«экспоненциальную»фазу,таккакоценкавфазу«плато»считаетсянеэффективнойиз-занарастающегоистощениякомпонентовреакционнойсмеси(рисунок13).
Рисунок13.Криваянакопленияпродукта.
ОтносительноеколичествомРНКрассчитывалиспомощьюdeltaметода.ОтносительноеколичествомРНКрассчитывалипоформуле:
∆=Ct(генов дом.хозяйства)-Сt(генаNF-kB)
гдеC(T)-пороговыйцикл(thresholdcycle),вычислялипроцентноесодержание∆отгеновдомашнегохозяйства(Gapdh).Темсамымбылопоказаноотносительноечислокопийисследуемогогенапоотношениюк
генамGapdh. ЧислокопийгеновGapdh10⁶-10⁷.