3 курс / Фармакология / НАУЧНО_МЕТОДИЧЕСКОЕ_ОБОСНОВАНИЕ_БИОСКРИНИНГОВЫХ_ПЛАТФОРМ_ДЛЯ_ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

41

нейротропных препаратов, а также их возможных взаимодействий

(McCarroll et al., 2016).

Наконец, зебраданио широко используются для изучения процессов обучения, памяти и нарушений данных функций. Большинство когнитивных тестов для рыб были адаптированы на основе тестов для грызунов, позволяя оценить привыкание, пассивное и активное избегание, а также пространственное ориентирование и визуальную память сигналов, форм и цветов (Bailey et al., 2015). Например, как и у грызунов, у зебраданио имеются парадигмы активного и пассивного избегания (Kim et al., 2010, Ng et al., 2012, Richetti et al., 2011, Seibt et al., 2011a, Truong et al., 2014), которые также могут быть использованы для оценки ассоциативной памяти и ее фармакологической модуляцией, в том числе при воздействии препаратов-нейролептиков (Seibt et al., 2011a),

амнестиков (например, скополамина и МК-801 (Kim et al., 2010, Richetti et al., 2011, Ng et al., 2012)), а также других нейротропных веществ.

Другие удобные и быстрые когнитивные тесты для оценки памяти зебраданио включают габитуацию (см ниже), различные лабиринты (Х-,

Т- и У- образные, Приложение 2), а также тесты на распознавание новых объектов, незнакомых рыб (Antunes and Biala, 2012, Lucon-Xiccato and Dadda, 2014) и визуальное различение цвета или узора (Колесникова и др., 2023). Данные модели часто используются для исследования оперантного научения, когда животное заплывает в правильный отсек при подкреплении (пища или демонстрация сородичей) и наказывается

(например, током или сачком) при заплыве в неправильный отсек (Pittman and Lott, 2014). Традиционные ноотропные препараты, например,

пирацетам, улучшают память зебраданио в данных тестах, тем самым демонстрируя предиктивную валидность акватических скрининговых платформ (Stewart and Kalueff, 2012).

https://t.me/medicina_free

42

1.4. Генетические особенности зебраданио

Произойдя от общего предка костных рыб примерно 340-400

миллионов лет назад (Amores et al., 2011, Meyer and Schartl, 1999),

зебраданио, как все костные рыбы, около 450 миллионов лет назад претерпели частичное удвоение (дупликацию) генома (Postlethwait et al., 1998). Данный процесс привел к увеличению числа изокопий для порядка

20-25% генов, в том числе затронув ряд генов рецепторов, транспортеров и ферментов синтеза и метаболизма нейротрансмиттеров, а также других ключевых мозговых генов. Именно поэтому, например, зебраданио экспрессируют примерно вдвое больше генов рецепторов биогенных аминов (серотонин, дофамин, гистамин, норадреналин/адреналин и следовые амины), чем мыши, и втрое больше, чем человек (Fredriksson and Schiöth, 2005, Panula et al., 2010). В целом, принято считать, что генетическая гомология зебраданио с человеком по кодирующим последовательностям (генам) составляет порядка 70% (Amores et al., 2011). При этом более 80% генов, ассоциированных с болезнями человека, имеют выраженные оргологи у зебраданио, тем самым подчеркивая генетическую релевантность моделей на рыбах для исследования генетической природы патогенеза человека (Cheresiz et al., 2020).

Зебраданио являются удобным модельным организмом для создания генетических моделей заболеваний ЦНС, поскольку (в силу особенностей своей генетики) у рыб создание генетически модифицированных (мутантных или трансгенных) линий на сегодняшний день с одной стороны облегчено наличием гораздо большего (чем у грызунов) арсенала генетических методов и технологий

(например, систем TALEN и CRISPR/Cas9), а с другой стороны требует на порядок меньшее время и финансовых и других лабораторных

https://t.me/medicina_free

43

ресурсов. Например, генетический нокдаун гена везикулярного транспортера моноаминов 2 (VMAT2) у зебраданио вызывает тревожно-

подобное поведение (снижение исследовательского поведения) (Wang et al., 2016), а нокаут гена ГР (gr/s357) вызывает депрессивно-подобный фенотип, в т.ч. частый фризинг, гипоактивность и повышение базального уровня кортизола (Griffiths et al., 2012). У рыб также были созданы многочисленные варианты генетических моделей болезни Альцгеймера

(Sundvik et al., 2013, Pu et al., 2017, Paquet et al., 2009, Lopez et al., 2017, Bai et al., 2007).

Зебраданио являются перспективным объектом и для фармакогенетических исследований, позволяя сочетать генетические манипуляции с действием нейротропных препаратов и потенциалом высокопроизводительного скрининга (Cunliffe, 2016). В частности,

блокатор гистаминовых рецепторов клемизол проявляет анти-

судорожные свойства у мутантных зебраданио по гену scn1lab

(кодирующего альфа-субъединицу натриевого канала 1.1 (Grone and Baraban, 2015)), которые являются генетической моделью синдрома Драве, формы врожденной эпилепсии у детей (Baraban et al., 2013).

1.5. Биоскрининг зебраданио на ранних стадиях развития

Зебраданио выгодно отличаются от многих других животных моделей тем, что для скрининга фармацевтических веществ на одном виде могут быть использованы фактически три модели – эмбрионы,

личинки и взрослые особи. С точки зрения тестирования нейротропных препаратов, следует отметить, что развитие нервной системы личинки происходит уже на вторые сутки после оплодотворения (Kimmel et al., 1995). В настоящее время эмбрионы рыб 1-2 дня после оплодотворения признаны эффективной моделью для оценки токсичности препаратов, в

т.ч. при скрининге по стандартам ZFET (Zebrafish Embryo Acute Toxicity

https://t.me/medicina_free

44

Test, исследование эмбриональной токсичности зебраданио) для анализа токсичности водных ксенобиотиков по проценту смертности и

нарушениям развития эмбрионов (Suvorova M., 2016).

Скрининг фармацевтических препаратов активно проводится и на личинках зебраданио, которые уже на 5-7 день после оплодотворения способны самостоятельно плавать и питаться, и могут позволить оценить общий уровень локомоции и тревожности в мульти-луночном планшете после введения линейки препаратов (Saint-Amant and Drapeau, 1998, Basnet et al., 2019, Suryanto et al., 2021). Данный тест может использоваться в качестве первичного скрининга при анализе эффектов различных нейротропных препаратов (Afrikanova et al., 2013, Colwill and Creton, 2011), например, оценивая гиперактивность или седацию у личинок зебраданио по пройденному расстоянию и скорости, а также аффективные (тревожно-подобные) фенотипы, которые проявляются в виде фризинга и фототаксиса (Blaser and Rosemberg, 2012, Chen et al., 2021). Личинки зебраданио представляют собой удобный объект для скрининга анксиолитических нейротропных препаратов (Lundegaard et al., 2015, Richendrfer et al., 2012), поскольку их пребывание на периферии арены (тигмотаксис), как и у взрослых рыб, отражает тревожное поведение и усиливается под действием анксиогенных препаратов

(Stewart et al., 2012a).

Личинки зебраданио могут использоваться для оценки зрительной и локомоторных функций в тесте зрительно-моторной реакции, в котором животные помещаются внутрь крутящегося барабана с чередующимися белыми и черными вертикальными полосами, и анализируют естественную способность плавать в направлении движения оптического потока (Scott et al., 2016, Thorn et al., 2019, Saint-Amant and Drapeau, 1998).

Поскольку данный фенотип контролируется различными

https://t.me/medicina_free

45

нейротрансмиттерами, в т.ч. глутамат-, холин- и моноамин-ергическими системами (Lovett-Barron et al., 2017, Yokogawa et al., 2012, Kawashima et al., 2016, Reinig et al., 2017), этот тест может быть использован для экспресс-оценки нейротропного профиля различных препаратов (Ganzen et al., 2021, Fadool and Dowling, 2008). Таким образом, личинки зебраданио, как и взрослые рыбы, представляют собой эффективные платформы для скрининга потенциальных терапевтических агентов,

направленных на коррекцию патологий ЦНС (Zimmermann et al., 2015, Dwivedi et al., 2019).

https://t.me/medicina_free

46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Экспериментальные животные

В исследовании использовались молодые взрослые (4-6 месяцев)

коротко-плавниковых зебраданио дикого типа (Приложение 1). Введение

лекарственных веществ проводилось методом вводной иммерсии

(погружением в раствор вещества) в остром эксперименте в контейнере объемом 250 мл в течении 20 мин, в хроническом - от 7-ми дней в контейнерах повседневного содержания (3.5 л). Все исследования были

проведены в соответствие с этическими принципами

экспериментирования на животных, а также национальными и международными стандартами содержания и использования животных в экспериментах. Работы с нейротропными препаратами проводились на основании действующих лицензий и в строгом соответствие с текущим законодательством. Контролируемые вещества исследовались на базе Университета Тулейна по лицензии Министерства юстиции США, и

результаты по этим препаратам опубликованы автором в международной печати. Исследования проводились при поддержке государственных заданий, собственных фондов и ресурсных центров СПбГУ, УРФУ,

НМИЦ им. В.А. Алмазова МЗ РФ, РНЦ РХТ им. акад. А.М. Гранова МЗ РФ, Университета Тулейна, Юго-западного университета, НИИ физиологии и медицины, НТУ “Сириус”, МФТИ, а также грантов Российского фонда фундаментальных исследований и Российского научного фонда.

В исследовании использовались аутбредные зебраданио дикого типа, который характеризуется большим генетическим разнообразием и изменчивостью, что максимально моделирует человеческую популяцию,

позволяя лучше изучить индивидуальные реакций, чем при

https://t.me/medicina_free

47

использовании генетически гомогенных линий рыб (Abreu et al., 2022).

Все исследования, а также их дизайн, планирование и представление научных результатов полностью соответствовали принципам,

сформулированным в руководствах ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) и PREPARE (Planning Research and Experimental Procedures on Animals: Recommendations for Excellence).

2.2. Поведенческое тестирование

Анализ поведения рыб проводился с помощью теста незнакомого аквариума (ТНА), теста построения косяка (ТПК), теста открытого поля

(ТОП), теста черно-белой камеры (ЧБК), теста иммобилизации хвоста

(ТИХ), теста условно-рефлекторного избегания места (УРИМ,

Приложение 2). Методологические основы анализа поведения рыб зебраданио подробно описаны в авторских монографиях и руководствах

(Kalueff and Cachat, 2011a,b; Kalueff and Stewart, 2012, Kalueff, 2017 и

Kalueff, 2023a,b). Стандартный ТНА состоял из узкого прямоугольного аквариума (высота 20 см × длина 20 см × ширина 5 см.), оценивая суммарное время и частоту заплыва в верхнюю часть аквариума,

дистанцию и скорость. Аппарат теста ЧБК состоял из пластикового контейнера (длина 50 см × ширина 20 см × высота 20 см), разделенного на два отделения равного размера: белое и черное. В тесте оценивались частота заплыва и время нахождения в светлой части аквариума. ТОП представлял собой открытую арену прямоугольной формы, разделенную условной линией на две зоны - центр и периферию (область 5 см от края стенок). Размеры аппарата варьировались (30 × 30 × 10 см, 56 × 40 × 28

см для прямоугольного, 21 см – диаметр, 24 см – высота для цилиндра).

Съемка экспериментальной установки велась сверху, оценивая время и частоту заплыва в центр арены.

https://t.me/medicina_free

48

ТПК выполнялся в аквариуме, аналогичном ТНА, куда помещали

4-6 рыб после предварительной экспозиции в растворе с лекарством.

После 5-минутной акклиматизации для нормализации группового поведения, осуществляли фотосъёмку косяка зебраданио после установленных равных промежутков времени (после каждых 5-10 с в течении 1-5 мин, после каждой минуты в течение 10 мин). Каждую фотографию откалибровали по размеру аквариума и измеряли расстояния

(в см) между каждой рыбой в группе. УРИМ предназначен для тестирования когнитивных свойств зебраданио, где рыбы подвергались воздействию аверсивного раздражителя (эл. ток) в темном отсеке (Collier et al., 2014). После обучения (4 часа с включенном эл. током в темном отсеке), в тесте оценивали время нахождения по отсекам. Размеры аппарата УРИМ составляли 30 см × 13 см × 12 см (длина × ширина × высота), он был разделен на два отсека одинакового размера центральной поднимающейся перегородкой. Для контраста две части камеры для УРПМ разделяли поровну непрозрачными пластиковыми самоклеящимися пленками разных цветов - белой и коричневой).

ТИХ использовался для оценки депрессивно-подобного поведения у рыб, одним из основных симптомов которых является гиполокомоция

(моторная ретардация). В ТИХ рыба была аккуратно перемещена из емкости в центральный разрез влажной вискозной губки так, чтобы хвостовая часть тела рыбы была зафиксирована, не ограничивая подвижность боковых плавников и передней части тела. Активность рыбы в губке был основным параметром, который оценивали в данном тесте по количеству подергиваний и общему времени активных движений рыбы за период теста (Demin et al., 2020b; Kositsyn et al., 2022).

https://t.me/medicina_free

49

Для вызова хронического стресса у рыб применялась модель хронического непредсказуемого стресса (ХНС), детально описанная в Приложении 3.

2.3. Нейрохимический анализ

Во цельном мозге зебраданио оценивали концентрацию норадреналина, серотонина (5-HT), дофамина и их метаболитов: 5-

гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA), 3,4-

дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC) и гомованилиновой кислоты (HVA) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Demin et al., 2020a, Wang et al., 2020a, Serikuly et al., 2020, Demin et al., 2020c, Meshalkina et al., 2018, Demin et al., 2017).

Рыб подвергали эвтаназии в ледяной воде после эксперимента, а их цельный мозг препарировали на льду и сразу помещали в жидкий азот (в

дальнейшем образцы хранили при температуре -800) (Wang et al., 2020a, Serikuly et al., 2020, Demin et al., 2020c, Meshalkina et al., 2018, Demin et al., 2017). В день анализа все образцы взвешивали и помещали в 10 мкл ледяного 0,1 М раствора хлорной кислоты (Sigma Aldrich, Сент-Луис,

США) с 100 нг/мл 3,4-дигидроксибензиламина (внутренний стандарт) на

1 мг ткани головного мозга для сохранения аналитов (Wang et al., 2020a, Serikuly et al., 2020, Demin et al., 2020c, Meshalkina et al., 2018, Demin et al., 2017).

Образцы далее обрабатывали ультразвуком в течение 10 с при половинной мощности, очищали центрифугированием и фильтровали через центрифужный фильтр Durapore-PVDF с размером пор 0,22 мкм

(Merck Millipore, Биллерика, США). ВЭЖХ выполняли с использованием колонки CA-5ODS и хроматографа HTEC-500 (Eicom, Сан-Диего, США)

с углеродным электродом WE-3 G с приложенным потенциалом +650 мВ,

аналогично (Demin et al., 2020a, Wang et al., 2020a, Serikuly et al., 2020,

https://t.me/medicina_free

50

Demin et al., 2020c, Meshalkina et al., 2018, Demin et al., 2017). Подвижная фаза для хроматографии состояла из 0,1 М фосфатного буфера, 400 мг/л

октилсульфоната натрия, 50 мг/л этилендиаминтетрауксусной кислоты

(ЭДТА), 17% метанола и доводилась до рН 4.5 фосфорной кислотой

(Sigma Aldrich). Данные о концентрациях были нормированы с использованием концентраций отдельных образцов DHBA и

представлены в виде пг/мг массы ткани головного мозга. В работе также оценивался оборот моноаминов в головном мозге по соотношению 5-

HIAA к серотонину, и DOPAC и HVA к дофамину.

2.4. Другие методики

Методики анализа фармакологических эффектов препаратов на основе оценки вибрации зебраданио, трехмерного нейрофенотипирования, построения габитуома и применения систем искусственного интеллекта изложены в тексте диссертации ниже.

2.5. Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием

Statistics 10 и GraphPad Prism 7 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния).

Непараметрические поведенческие и физиологические биомаркеры исследовались, используя тест Крускала-Уоллиса, с последующим попарным сравнением в тесте Данна или U-тесте Манна-Уитни (с

коррекцией Бонферрони). Дисперсионный анализ (ANOVA)

использовались для анализа нормально распределенных показателей.

Конкретные тесты, использованные для анализа уточнены в каждом конкретном разделе. Значения выражены как среднее значение по группе

± стандартная ошибка среднего.

https://t.me/medicina_free