9. Методы индикации вирусов в биологических моделях.

Для индикации вирусов в куриных эмбрионах отмечают видимые изменения в развитии эмбриона: кровоизлияния, образование бляшек на оболочках. С жидкостью, содержащейся в полостях эмбриона, также возможна постановка реакции гемагглютинации.

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности вирусов вызывать склеивание эритроцитов различных видов животных, птиц и человека. РГА не является серологической, так как склеивание эритроцитов идет без участия иммунной сыворотки. Гемагглютинины, способные вызывать склеивание эритроцитов, - глико- и липопротеины суперкапсида. У вирусов, не имеющих внешней оболочки, гемагглютинин связан со структурами капсида.

Механизм реакции гемагглютинации включает несколько стадий:

• адсорбцию вируса на эритроците за счет комплементарных рецепторов вируса и эритроцита;

• склеивание - агглютинацию эритроцитов;

• элюцию - разрушение вирусными ферментами рецепторов эритроцитов и отрыв вируса с поверхности клетки

Для постановки РГА необходимы:

• вируссодержащий материал (аллантоисная жидкость куриного эмбриона, культуральная жидкость, материал, взятый от зараженного животного, и др.);

• 1% взвесь эритроцитов (кур, морской свинки, человека) в изотоническом растворе натрия хлорда;

• изотонический раствор натрия хлорида (электролит).

Реакцию ставят в лунках плексигласового планшета. Вначале во все лунки разливают изотонический раствор натрия хлорида. В первую лунку добавляют 0,5 мл вируссодержащего материала и тщательно перемешивают. Затем последовательно переносят по 0,5 мл полученного разведения из предыдущей лунки в последующую. Таким образом получают двукратные разведения (в каждой лунке 0,5 мл вируссодержащего материала, концентрация которого уменьшается в 2 раза в каждой последующей лунке). Из предпоследней лунки 0,5 мл удаляют в дезинфицирующий раствор (контроль - для исключения спонтанной, самопроизвольной гемагглютинации). После приготовления разведений вируссодержащего материала во все лунки, включая контрольную, добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, выдерживают 30-45 мин при комнатной температуре и регистрируют результаты.

• При положительной реакции гемагглютинации осадок эритроцитов зернистый и располагается по всей поверхности дна лунки в виде зонтика с фестончатыми краями.

• При отсутствии гемагглютинации осадок эритроцитов плотный, маленький, круглой формы в самом центре лунки.

• В контрольной лунке гемагглютинация отсутствует.

С помощью РГА определяют наличие вируса в исследуемом материале и его количество - титр, который выражается в гемагглютинирующих единицах (ГАЕ), - максимальном разведении вируссодержащего материала, которое полностью агглютинирует стандартную суспензию эритроцитов.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят по следующим признакам.

• Цитопатическому действию. При этом могут образовываться гигантские многоядерные клетки и симпласты (слияние цитоплазмы многих клеток), наблюдаются деструкция клеток, вакуолизация цитоплазмы. Возможно образование включений - цитоплазматических и внутриядерных. Внутриклеточные включения - это скопления вирусных частиц или их компонентов, выявляемые под микроскопом.

• Бляшкообразованию. Бляшки, или негативные колонии, - ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток, которые вирусы способны образовывать в монослое клеток под агаровым покрытием, содержащим витальный краситель, окрашивающий только живые клетки. Они видны как светлые пятна на фоне красного слоя клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным витальным красителем. Одна бляшка соответствует потомству одного вириона. Негативные колонии разных вирусов различаются по размеру, форме. Бляшкообразование используют для дифференциации, селекции вирусов, а также для определения их концентрации в исследуемом материале.

• Цветной пробе. В 1954 г. Д. Солк разработал так называемую цветную пробу для обнаружения вирусов в исследуемом материале. В основе данной методики лежат следующие особенности. Незараженные вирусом культуры клеток выделяют продукты метаболизма, которые подкисляют питательную среду, используемую для культивирования клеток, и окрашивают добавляемый в среду индикатор феноловый красный в желтый цвет. Если исследуемый материал содержит вирусы, то при добавлении его к культуре клеток вирусы убивают их, нормальный метаболизм клеток нарушается, в результате среда сохраняет свой первоначальный красный цвет.

• Гемадсорбции - способности культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты определенных видов животных и птиц. Гемадсорбция проявляется скоплением в виде гроздей эритроцитов, адсорбированных на инфицированных вирусом клетках.

Индикацию вирусов в культуре клеток проводят также постановкой РГА с культуральной жидкостью. В настоящее время для этой цели используют также ПЦР и иммуноферментный анализ (ИФА).

После обнаружения вируса в исследуемом материале проводят его идентификацию Идентификация означает установление вида или типа вируса, ее осуществляют в основном с помощью реакций иммунитета или молекулярно-генетических методов. Широко используют реакцию биологической нейтрализации - метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционности в результате взаимодействия со специфическими антителами. Эту реакцию используют при выделении и индикации вируса на культурах клеток. Для идентификации используют также другие серологические реакции, такие как ИФА, РСК, РТГА и молекулярно-генетические методы (ПЦР).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - серологическая реакция, основанная на способности антител предотвращать агглютинацию эритроцитов гемагглютинирующими вирусами (аденовирусами, вирусами гриппа). Специфические антивирусные антитела взаимодействуют с поверхностными молекулами гемагглютининов вирионов этих вирусов и блокируют их связывание с комплементарными им молекулами мембраны эритроцитов. Реакцию используют для определения титров специфических антител, а также для идентификации вирусов. Реакцию ставят в полистероловых планшетах с лунками. Постановке реакции предшествует определение активности вирусного антигена, титр которого определяют в реакции вирусной гемагглютинации (РГА). В опыте используют рабочую дозу в количестве 4-8 ГАЕ. Для постановки реакции необходимы:

• вируссодержащий материал (аллантоисная жидкость куриного эмбриона, культуральная жидкость, материал от больного и др.). Вируссодержащий материал титруют в РГА и берут в опыт в рабочей дозе, равной 2, 4 или 8 ГАЕ;

• сыворотка:

— диагностическая (если определяют тип вируса);

— исследуемая (сыворотка больного, вакцинированного, иммунизированного животного);

• эритроциты - 1% взвесь в изотоническом растворе натрия хлорида.

Реакцию ставят в лунках плексигласового планшета. Во все лунки, кроме первой, наливают по 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем в первую и вторую лунки вносят по 0,25 мл сыворотки, разведенной в соотношении 1:10, и тщательно перемешивают. Во второй лунке получается объем 0,5 мл, разведение сыворотки - 1:20. Из второй лунки 0,25 мл переносят в третью, из третьей 0,25 мл - в четвертую, из четвертой 0,25 мл - в пятую, из пятой 0,25 мл выливают в дезинфицирующий раствор. К приготовленным разведениям сыворотки добавляют по 0,25 мл антигена (вируссодержащего материала) и оставляют при комнатной температуре на 20-30 мин. Через 20-30 во все пробирки доливают по 0,5 мл 1% суспензии эритроцитов. Для достоверности результатов ставят контроли всех компонентов, участвующих в реакции. Через 20-30 мин учитывают результаты.

• Реакцию считают положительной, если образуется плотный, маленький, круглой формы осадок эритроцитов в самом центре лунки, т.е. наблюдается торможение (отсутствие) гемагглютинации.

• Если осадок эритроцитов зернистый и располагается по всей поверхности дна лунки в виде зонтика с фестончатыми краями - реакция отрицательная.

Последнее (наибольшее) разведение сыворотки, способное задержать реакцию гемагглютинации, называют титром сыворотки. Результаты реакции со специфической и неспецифической сыворотками заносят в таблицу.