- •Оглавление
- •РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ
- •Задание 1.1.1. Выделение плазмидной ДНК
- •Задание 1.2.2. Трансформация клеток E. сoli электропорацией
- •Задание 1.5.1. Приготовление смесей дНТФ/Cy5 ддНТФ
- •Задание 1.5.2. Постановка реакции
- •Задание 1.5.3. Осаждение и нанесение образцов на гель
- •Задание 1.5.4. Заливка геля и постановка электрофореза
- •Задание 1.5.5. Анализ сиквенсов
- •Задание 1.6.1. Выделение ДНК из биомассы водорослей
- •Задание 1.6.3. Проведение секвенирования
- •Задание 1.6.4. Анализ полученных данных
- •РАЗДЕЛ 2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
- •Задание 2.2.1. Проведение электрофореза выделенной ДНК в агарозном геле
- •Задание 2.2.4. Определение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра
- •Задание 2.3.2. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК с помощью электрофореза
- •Порядок выполнения работы
- •РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ И ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
- •Задание 3.5.1 Приготовление питательной среды
- •Задание 3.6.3. Посев клеток на материалах
- •Задание 3.6.5. Подсчет клеток
- •Задание 3.6.6. Процесс трипсинизации клеток
- •Задание 3.8.1. Освоение техники субкультивирования клеток
- •Задание 3.8.2. Замораживание прикрепленных клеток
- •РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Технология микроклонального размножения растений
- •Задание 4.3.1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля
- •РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
- •Задание 5.6.1. Определение показателей роста и спорообразования грибных культур поверхностным и глубинным способом
- •Задание 5.8.1. Освоить методы культивирования микроводорослей
- •РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ
- •Задание 6.10.1. Снятие ИК-спектра полигидроксибутирата
- •РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
- •Задание 7.1.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.2.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.2.3. Проверка светорассеяния в исследуемых образцах
- •Составление отчета
- •4. Составление отчета.
- •Задание 7.4.1. Приготовление образцов для исследования.
- •Задание 7.4.2. Исследование спектров люминесценции.
- •Задание 7.5.1. Оценить численность микроорганизмов в водных образцах
- •РАЗДЕЛ 8. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ФОТОСИТЕЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ
- •РАЗДЕЛ 9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ
- •Задание 9.1.3. Определение константы Михаэлиса. Специфичность
- •Задание 9.2.2. Определение типов взаимодействия эффекторов с ферментом по отношению к субстрату
- •РАЗДЕЛ 10. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
- •Задание 10.3.1. Выделение ДНК из биопроб
- •Задание 10.5.1. Построение абсолютного калибровочного графика зависимости концентрации глюкозы в пробе от изменений оптической плотности
- •Задание 10.7.1. Исследование образца крови на анализаторе МЕК-6400J/К
- •РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ
- •Задание 11.4.1. Ознакомление с метордом автоматической фотоколориметрии
- •РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
- •РАЗДЕЛ 1
- •РАЗДЕЛ 2
- •РАЗДЕЛ 3
- •РАЗДЕЛ 4
- •РАЗДЕЛ 5
- •РАЗДЕЛ 6
- •РАЗДЕЛ 7
- •РАЗДЕЛ 8
- •РАЗДЕЛ 9
- •РАЗДЕЛ 10
- •РАЗДЕЛ 11
- •Приложение. Перечень научного оборудования, использованного в лабораторном практикуме
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
Цель работ раздела
• дать представление об основных принципах применения методов абсорбционной и люминесцентной спектроскопии и микроскопии для исследования биологических объектов разной сложности – от молекул пигментов до бактериальных клеток.
Задачи раздела
•ознакомиться с основными закономерностям взаимодействия электромагнитного излучения с биологическими объектами;
•ознакомиться сосновными принципами работы на оптических приборах.
Объекты исследования: пигменты растений, растворы белков и ДНК, суспензии бактериальных клеток, окрашенные мазки эритроцитов, природная и водопроводная вода.
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие |
344 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА7.1. АБСОРБЦИОННЫЙАНАЛИЗПИГМЕНТОВРАСТЕНИЙ
Цель лабораторной работы
•изучение принципов идентификации и количественного анализа пигментов высших растений спектрофотометрическим методом.
Краткие теоретические сведения
Световая волна состоит из взаимно перпендикулярных электрического и магнитного полей, амплитуды которых по мере распространения в пространстве изменяются по синусоиде. Когда волна сталкивается с молекулой, она может либо рассеиваться (т. е. изменяется направление ее распространения), либо поглощаться (т. е. ее энергия передается молекуле). Относительная вероятность протекания того или иного процесса является свойством той молекулы, с которой произошло столкновение. Если произошло поглощение электромагнитной энергии света, о молекуле говорят, что она возбуждена или перешла в возбужденное состояние. Молекула или часть молекулы, которая может быть возбуждена посредством поглощения света в видимой и ближней УФ-области, называется хромофором. Возбужденная молекула обладает набором дискретных квантованных энергетических состояний, описываемых законами квантовой механики. Эти состояния называются энергетическими уровнями молекулы. Самый низкий электронный уровень называется основным состоянием, а все другие — возбужденными.
Поглощение энергии происходит с наибольшей вероятностью только в том случае, если количество поглощенной энергии соответствует разности энергий квантованных состояний. Это можно выразить, констатируя, что свет с длиной волны λ поглощается только тогда, когда
λ = |
|
hc |
, |
(7.1) |
|
E2 |
− E1 |
||||
|
|
|
где Е1 — энергетический уровень молекулы до поглощения, а Е2 — энергетический уровень, достигаемый в результате поглощения.
Изменение энергетического состояния при испускании или поглощении кванта называется переходом. Упрощенно переход между электронными энергетическими уровнями соответствует энергии, необходимой для перемещения электрона с одной орбитали на другую. На схеме энергетических
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие |
345 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ
уровней переходы изображаются вертикальными стрелками. Далеко не все переходы реализуются с высокой вероятностью; в реальных системах действуют определенные ограничения, или правила отбора квантовой механики. Зависимость вероятности поглощения от длины волны называется спектром поглощения. Задание абсорбционной спектроскопии состоит в накоплении и анализе данных по поглощению. Если бы все переходы происходили только между самыми низкими колебательными уровнями основного состояния и первого возбужденного состояния, тогда спектр поглощения состоял бы из узких, дискретных линий. Однако поскольку возможны переходы с основного состояния на любой колебательный и вращательный уровни первого возбужденного состояния, а линии имеют конечную ширину, то спектр проявляется в виде относительно плавной кривой. Для большинства молекул длины волн, соответствующие переходам между основным состоянием и любым колебательным уровнем первого возбужденного состояния, лежат в ультрафиолетовой и видимой области спектра.
Вероятность перехода при одной длине волны характеризуется коэффициентом экстинкции при этой длине волны. Если концентрация вещества выражена в г моль/л, а толщина слоя – в см, то этот коэффициент называют
молярным коэффициентом экстинкции и обозначают ε или ελ. Если свет ин-
тенсивности I0 проходит через раствор с толщиной слоя d и концентрацией с, интенсивность прошедшего света подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера:
I = I0 10 |
−ε d c |
, т. е. |
lg |
I |
= −ε d c |
или lg |
I0 |
=ε d c |
(7.2) |
|
|
I |
|||||||
|
I0 |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
где ε — молярный коэффициент экстинкции. Результаты измерения выражают либо как процент пропускания T%, либо, гораздо чаще, как поглощение А или оптическая плотность D (иногда ODλ). Эти величины задаются выражениями:
T% = |
I |
×100 ; |
A = D = lg II0 . |
(7.3) |
I0 |
Оптической плотностью удобно пользоваться, так как при d=1 см она равняется ε×с. В некоторых случаях, если свелико, ε становится функцией с, и тогда можно сказать, что закон Бугера-Ламберта-Бера нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например,
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
346 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ
димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях.
Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов. Несмотря на различия в конструкции все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света (как правило, состоящего из фотоэлектронного умножителя ФЭУ) и системы вывода данных (компьютер, дисплей, реже – самописец) для регистрации выходного сигнала детектора (рис. 7.1).
Порядок выполнения работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через кювету сравнения, наполненную растворителем, в котором приготовлен образец (например, буфер или вода), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся в различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучений.
Рис. 7.1. Принципиальная схема устройства спектрофотометра
Свет от лампы 1 проходит сквозь монохроматор 2 для выделения пучка света с определенной длиной волны. Монохроматичный свет проходит сквозь кювету с образцом 3 или растворителем 4, помещенную в держатель
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
347 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ
для кювет 5, затем попадает на регистрирующее устройство (ФЭУ) 6, сигнал с которого передается измерительному прибору 7.
На рис. 7.2 показаны спектры, снятые в видимой и УФ-областях для двух биологических молекул. Обычно определяют величины D или ε. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения, называется λмакс, и именно при этой длине волны обычно определяют ε. Некоторые полосы поглощения состоят из многочисленных пиков, и часто регистрируют длины волн, соответствующие пикам, имеющим меньшие молярные коэффициенты поглощения. Эти длины волн иногда также называют λмакс или указывают, что вещество имеет максимумы поглощения при λ1 , λ2 , λ3, ... λn. Иногда измеряют ширину полосы, хотя и не обязательно.
В табл. 7.1 приведен список величин λмакс и ε хромофоров, часто встречающихся в биологических объектах.
Рис. 7.2. Сравнение спектров поглощения двух биологических молекул: а – флавинмононуклеотида, б – фикоцианина. Спектры можно использовать для идентификации соединения
Спектр поглощения хромофора определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако λмакс и ε претерпевают заметные изменения и под влиянием окружения. Влияние окружения состоит в следующем.
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
348 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ
Таблица 7.1
Максимумы поглощения и молярные коэффициенты экстинкции различных веществ, используемых для биологических исследований, при нейтральном рН
Соединение |
λmax, нм |
ε при λmax, M-1 см-1 (×10-3) |
Триптофан* |
219; 280 |
47; 5,6 |
|
|
|
Тирозин* |
193; 222; 274 |
28; 8; 1.4 |
|
|
|
Фенилаланин* |
188; 206; 257 |
60; 9,3; 0,2 |
|
|
|
Гистидин* |
211 |
5,9 |
|
|
|
Цистеин* |
250 |
0,3 |
Аденин |
260,5 |
13,4 |
Аденозин |
259,5 |
14,9 |
Гуанин |
246 |
10,7 |
|
|
|
Гуанозин |
252,5 |
13,6 |
|
|
|
Цитозин |
267 |
6,1 |
|
|
|
Цитидин |
271 |
9,1 |
|
|
|
Урацил |
259,5 |
8,2 |
|
|
|
Уридин |
261,1 |
10,1 |
Тимин |
264,5 |
7,9 |
Тимидин |
267 |
9,7 |
ДНК |
258 |
6,6 |
|
|
|
РНК |
258 |
7,4 |
*Поглощение других аминокислот незначительно
Эффект рН. рН раствора определяет ионную форму ионизуемых хромофоров.
Эффект полярности. В случае полярных хромофоров часто справед-
ливо (особенно если молекула содержит О, N или S), что λмакс наблюдается при более коротких длинах волн в полярных растворителях, содержащих
гидроксил (НО, спиртах), чем в неполярных.
Эффекты ориентации. Величины λмах и ε существенно зависят от геометрических особенностей молекул. Наиболее известна гипохромия нуклеиновых кислот, т. е. понижение коэффициента экстинкции нуклеотида, при условии, что нуклеотид входит в состав одноцепочечного полинуклеотида, в котором нуклеиновые основания сближены и расположены друг над другом.
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
349 |
РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ
Дальнейшее понижение ε наблюдается для двухспиральных полинуклеотидов, так как основания в этом случае еще более упорядочены.
Измерение спектров поглощения биологических препаратов существенно отличается от измерения спектров растворов веществ. Гетерогенность биологических образцов приводит к проявлению эффектов проскока (или сита), светорассеяния. Более подробно узнать о данных эффектах следует из литературных источников.
Задачи, решаемые с помощью абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ-областях спектра:
•измерение концентрации;
•исследование скоростей химических реакций;
•идентификация веществ путем спектральных измерений;
•переход спираль — клубок в двухцепочечной ДНК: денатурация и ренатурация;
•спектрофотометрическое титрование белков;
•переход спираль — клубок в белках (денатурация);
•обнаружение связывания с белками малых молекул;
•реакции ассоциации белков.
Материалы и оборудование
1.Дистиллированная вода, этанол или ацетон, лист растения.
2.Оборудование: спектрофотометр Genesis 10UV, автоматические микропипетки.
3.Вспомогательные материалы: ступка, пестик, ножницы, воронка, фильтровальная бумага, марля.
Характеристики оборудования
СпектрофотометрGenesis 10UV
Технические характеристики спектрофотометра Genesis 10UV (Thermo Scientific, USA) (рис. 7.3)
|
Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие |
350 |