- •Основные обозначения
- •Введение
- •СПЕКТРАЛЬНЫЕ (ОПТИЧЕСКИЕ) МЕТОДЫ АНАЛИЗА
- •Основные характеристики электромагнитного излучения
- •Спектр электромагнитных колебаний
- •Глава 1. Абсорбционная спектроскопия
- •1.1. Законы поглощения света
- •1.2.2. Спектры поглощения
- •1.2.3. Устройство приборов
- •1.2.4. Практическое применение
- •1. Определение фенолов.
- •2. Определение аминов.
- •3. Определение кетонов.
- •1.2.5. Практические работы
- •Работа 1. Определение хрома дифенилкарбазидным методом
- •Выполнение работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •1.3. Инфракрасная (колебательная) спектроскопия
- •1.3.1. Элементарная теория колебательных спектров
- •1.3.2. Спектры поглощения
- •Количественный анализ по инфракрасным спектрам.
- •1.3.4. Устройство приборов
- •1.3.5. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Глава 2. Эмиссионная спектроскопия
- •2.3. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
- •Глава 3. Кондуктометрия
- •3.1. Электропроводность растворов электролитов
- •3.1.1. Удельная электропроводность
- •3.1.2. Эквивалентная электропроводность
- •3.2. Электропроводность природных вод
- •3.3. Кондуктометрическое титрование
- •Титрование сильной кислоты сильным основанием
- •Титрование слабой кислоты сильным основанием
- •3.4. Практические работы
- •Кондуктометр ОК 102/1
- •Порядок работы на приборе
- •Выполнение работы
- •Работа 2. Определение удельной электропроводности воды
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Глава 4. Потенциометрия
- •4.1. Электродный потенциал
- •4.2. Электроды сравнения
- •4.3. Диффузионный потенциал
- •4.4. Прямая потенциометрия
- •4.4.2. Ионоселективные электроды
- •4.5. Потенциометрическое титрование
- •4.7. Практические работы
- •Порядок работы
- •Ход работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Глава 5. Вольтамперометрия
- •5.1. Кривая ток-потенциал
- •5.2. Полярографический фон
- •5.3. Диффузионный ток
- •5.4. Количественный полярографический анализ
- •5.5. Качественный полярографический анализ
- •5.6. Полярографическая установка
- •5.7. Хроноамперометрия с линейной разверткой потенциала
- •5.8. Инверсионная вольтамперометрия
- •5.9. Практическое применение
- •5.10. Практические работы
- •Работа 1. Обнаружение ионов Cu2+, Cd2+, Zn2+, Mn2+
- •Выполнение работы
- •Работа 2. Обнаружение ионов Pb2+ и Tl+
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Глава 6. Электрофорез
- •6.1. Общие принципы электрофореза
- •1. Форма и величина белковой молекулы.
- •2. Электрическое поле.
- •3. Характер буфера и его ионная сила.
- •4. Природа носителя.
- •6.2. Электрофорез на бумаге и ацетате целлюлозы
- •6.3. Электрофорез в гелях
- •6.4. Диск-электрофорез
- •6.5. Применение метода диск-электрофореза
- •6.6. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Проведение электрофореза
- •Обнаружение белковых фракций
- •Хранение и реставрация гелей
- •Техника безопасности при работе методом электрофореза
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •6.8. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
- •Глава 7. Общие принципы хроматографии
- •7.2. Классификация хроматографических методов
- •7.3. Применение методов хроматографии
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Глава 8. Жидкостная хроматография
- •8.1.1. Хроматография на колонке
- •8.1.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ)
- •8.1.3. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •8.2. Жидкостно-жидкостная (распределительная) хроматография
- •8.2.1. Теоретические основы метода
- •8.2.2. Хроматография на бумаге
- •8.2.3. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •8.3. Ионообменная хроматография
- •8.3.1. Теоретические основы метода
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •8.4. Проникающая или эксклюзионная хроматорафия
- •8.4.1. Теоретические основы метода
- •8.4.2. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •8.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
- •8.5.1. Теоретические основы метода
- •8.5.2. Практические работы
- •Выполнение работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •8.6. Понятие об аффинной или биоспецифической хроматографии
- •Контрольные вопросы
- •Литература
- •Глава 9. Газовая хроматография
- •9.1. Теоретические основы метода
- •9.2. Аппаратурное оформление газовой хроматографии
- •9.3. Качественный и количественный анализ
- •9.4. Применение газовой хроматографии
- •9.5. Практические работы
- •Контрольные вопросы
- •Литература
6.7.Метод энзимэлектрофореза
вполиакриламидном геле
Существует несколько способов обнаружения ферментов методом электрофореза в полиакриламидном геле, но основными являются два: окрашиваниегеляиэлектрофорезвгелях, содержащихсубстрат.
Окрашивание геля заключается в следующем. Гель вынимают из трубки и выявляют ферментативную активность отдельных белковых фракций непосредственно на гелевых колонках с помощью химических реакций, протекающих в специально подготовленных инкубационных средах. Инкубационные среды специфичны для каждого фермента. В местах локализации фермента обнаруживают окрашенные зоны. При втором способе субстрат вводят в гель, а затем инкубируют гель при нормальных условиях с соответствующимикрасителями.
6.8. Практические работы
Работа 1. Обнаружение амилазы в тканях животного происхождения методом электрофореза
в полиакриламидном геле
Ферменты амилазного комплекса ускоряют гидролиз полисахаридов (крахмала, гликогена) с образованием разнообразных промежуточных и конечных продуктов.
Как известно, крахмал существует в двух формах: в виде амилозы и амилопектина. Амилоза состоит из длинных неразветвленных цепей, в которых все Д-глюкозные остатки соединены α-1,4 связями. Цепи эти полидисперсны. Их молекулярная масса варьирует от нескольких тысяч до 500 000. В воде амилоза не дает истинного раствора, но образует гидратированные мицеллы, которые при добавлении йода окрашиваются в синий цвет. Цепи амилопектина сильно разветвлены. Остов молекулы амилопектина имеет α-1,4 гликозидные связи, а в точках ветвления α- 1,6 связи. Амилопектин образует коллоидные растворы, которые при добавлении йода окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Молекулярная масса амилопектина может достигать 1 млн.
Основные компоненты крахмала гидролизуются ферментативным путем разными способами. Амилоза может быть гидролизована при участии α- и β-амилаз. α -амилаза или 1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, ускоряет гидролиз α-1,4 связей без какого-либо определенного порядка, в результате чего сначала возникают олигосахариды, которые также подвержены действию α-амилазы, если они содержат три и более ос-
111
татков Д-глюкозы. В конечном счете получается смесь α-мальтозы и Д-глюкозы. α-амилаза найдена у всех растений и животных.
Фермент β -амилаза (или α -1,4-глюканмальтогидролаза) ускоряет реакцию гидролиза амилозы по 1,4 связям, последовательно отщепляя остатки β -мальтозы с нередуцирующего конца. β -амилаза характерна только для высших растений.
В природе найдена также γ -амилаза, или α -1,4-глюкан- глюкогидролаза, ускоряющая гидролиз 1,4-связей в крахмале так, что последовательно отщепляются остатки глюкозы, начиная с нередуцирующего конца.
Амилопектин также гидролизуется при участии α ,β γ , -амилаз, но так как все эти амилазы не способны расщеплять α -1,6-связи в точках ветвления амилопектина, то конечным продуктом при действии амилаз на амилопектин является крупная, сильно разветвленная "сердцевина" полисахарида, называемая остаточным декстрином. α -1,4- связи в нем гидролизуются при участии особых ферментов (α -1,6- глюкозидаз).
В исследуемых препаратах в основном содержится α -амилаза. Выявление ферментативной активности амилазы проводят, используя реакцию взаимодействия крахмала и продуктов его гидролиза с йодом.
Оборудование и реактивы. Приборы и реактивы для определения белка по методу Лоури, приборы и реактивы для проведения электрофореза в ПААГе, трис-глициновый буфер, разбавленный в 5 раз, 1%-ный раствор растворимого крахмала, ацетатный буфер (рН = 5,6), раствор йода, тканевые экстракты, термостат на 37°С.
Выполнение работы
Колонки полиакриламидного геля готовят в соответствии с прописью, приведенной ранее (работа 1, стр. 105-106), только вместо 1 части воды при приготовлении нижнего геля берут 1 часть раствора крахмала. В исследуемом образце определяют содержание белка по методу Лоури и разбавляют его 40%-ным раствором сахарозы до содержания белка 4 000 - 6 000 мкг/мл. На каждую колонку полиакриламидного геля наносят по 0,1 мл белкового экстракта, содержащего 400 - 600 мкг белка, и проводят электрофоретическое разделение по методу, описанному ниже. По завершении электрофореза гелевую колонку извлекают из трубки и инкубируют в ацетатном буфере (рН = 5,6) при 37°С в течение часа, затем буферный раствор сливают, гель промывают водой и заливают раствором йода.
ВНИМАНИЕ! Перед употреблением раствор йода разбавляют в 6 раз.
112