Легенды и мифы о фиксации и проводке ткани
Пешков М. В. Таганрог 2013
Maxim_71@mail.ru
Миф гистологической технологии: «стандартный метод»
Имеется стандартный метод приготовления препаратов.
Нет стандартных и универсальных методов в гистологии.
Есть чаще или реже используемые.
Каждый метод укореняется в лаборатории под давлением обстоятельств.
Выполнение одинаковым способом подобной работы в большинстве лабораторий позволяет достичь одинаковых результатов.
Фиксация: Миф 1 Универсальный фиксатор
Имеется стандартный и универсальный фиксатор: 10% нейтральный забуференный формалин.
Нет стандартных и универсальных фиксаторов. Есть чаще используемые или подходящие для многих целей.
10% нейтральный забуференный формалин пригоден как для обзорных целей, так и для иммуногистохимии. Он дешев и широко распространен, отлично подходит для массовой рутинной гистологии. При его использовании удается получить результат при многих молекулярных тестах
(FISH, CISH. Dual CISH и т.п.)
Химик, физик и патолог
Александр Бутлеров
Фердинанд Блюм
Карл Вейгерт
История формальдегида как фиксатора в микротехнике
1845- |
585 фиксаторов, |
|
|
1954 |
Из которых 217 с формалином |
1900-1954 |
|
• |
413 |
новых фиксаторов |
1880-1899 |
|
• |
159 |
фиксаторов, 25 с формалином |
1841-1879 |
|
• |
30 фиксаторов без формалина |
|
|
|
|
|
|
1893 |
• |
Weigert K. Предпочтительный фиксатор |
||
1890 |
• |
Bloom F. Введение в микротехнику |
||
1859 |
• |
Бутлеров А.М. Открытие вещества |
||
Формалин как фиксатор сегодня
Фосфаты не дают |
Фиксатор выбора: |
+ соли цинка |
окисляться формалину в |
Большинство |
+ уксусная кислота |
муравьиную кислоту, а |
лабораторий России, |
+ спирт |
она замедляет |
81% США, Англии и |
|
фиксацию и вызывает |
около 2/3 лабораторий |
|
образование |
всего остального мира. |
|
«формалинового» |
|
|
пигмента в тканях, |
|
Варианты |
богатых кровью. |
География |
|
Фосфаты |
|
|
|
|
|
|
Формалин без буфера |
|
10% забуференный формалин |
|
|
|
|
|
|
|
+ соли фосфорной кислоты |
|
Нет четких деталей хроматина; |
|
|
«формалиновый» пигмент, не |
||
рН 7.0 |
|
||
|
сохраняется часть белков |
||
|
|
||
Предварительно забуференный концентрат
Формальдегид-концентрат + буфер
Основные силы буфера расходуются на нейтрализацию муравьиной кислоты – ингибитора полимеризации концентрата. Следовательно, такой продукт при разведении будет иметь гораздо меньшую буферную емкость, т.е. будет подобен обычному концентрату, разведенному водопроводной водой.
Фиксация: Миф 2 Быстро фиксирующие жидкости
Имеется быстрый фиксатор:
Жидкость Карнуа (этанол+хлороформ+уксусная кислота).
Да, время фиксации им значительно меньше,
чем формалином, но механизм фиксации совсем иной, соответственно и морфология отличается от формалина.
Не подходит для части маркеров ИГХ. Дороже формалина.
В состав входит хлороформ – токсичное и канцерогенное вещество.
Необходимы соответствующие условия работы.
В итоге: скорость не всегда оправдана, а зачастую может нанести непоправимый ущерб.
Фиксация: Миф 3 Время фиксации формалином - часы
Время фиксации образцов тканей 10% нейтральным забуференным формалином составляет 2-4 часа,
мелких – 1 час.
Термин «фиксация» здесь путают с «пропитыванием».
Да, ткани действительно пропитываются формалином со скоростью до 1 мм/ч (при толщине не более 0.5 см).
Время ФИКСАЦИИ формалином не меньше 24 часов при комнатной температуре для объектов толщиной от 0.5 мм до 3 мм,
а для объектов 4-5 мм – 48-72 часа.
Этапы фиксации формалином
Формалин быстро проникает в ткани, Вдвое медленнее ковалентно связывается с белками,
В 8 раз медленнее образует перекрестные связи.
Пропитывание Связывание Фиксация
х |
|
х/2 |
|
х/8 |
|
|
|
|
|