8542

3

СОДЕРЖАНИЕ

Лабораторная работа №4.Микроскопическое изучение кариотипов животных и растительных клеток………………………………………..19

Лабораторная работа №5. Анафазный метод учета перестроек хромосом …………………………………………………………………..24

Лабораторная работа №6. Методы учета индуцированных микроядер

Лабораторная работа №7. Метафазный анализ перестроек хромосом у

Лабораторная работа № 9. Изучение гигантских хромосом в слюнных железах личинки хирономуса………………………… ……… ………….40

Лабораторная работа № 10.Биологический контроль водоема методом

Лабораторная работа №11.Биологический анализ активного ила…...51

Лабораторная работа № 12.Определение качества воды в пресноводном водоеме по видовому разнообразию зообентоса….........64

4

5

Лабораторная работа №1

Тема. Принципы работы светового микроскопа. Клеточный / митотический / цикл.

Цель работы. Ознакомиться с устройством и принципами действия светового микроскопа при помощи определения митотического индекса.

Задачи. 1. Ознакомиться с устройством и принципами действия светового микроскопа.

2.Закрепить знания о принципах действия микроскопа путем подсчета числа клеток в зоне деления корешка на примере лука; подсчет клеток производить на разных фазах митотического цикла.

3.Определить митотический индекс, используя временные и. постоянные препараты корешка лука; полученные результаты сравнить.

4.Данные занести в таблицу.

5.Сделать выводы.

Материалы и оборудование:

-микроскопы,

-настольные лампы,

-временные и постоянные препараты корешков лука. Теоретическая часть. Устройство и технические характеристики

светового микроскопа.

Основная часть микроскопа - это оптический узел, который состоит из осветительной системы / зеркало и конденсор /, объективов и окуляров вместе с тубусом. Все части оптического узла строго центрированы.

Конденсор с ирисовой диафрагмой расположены под столиком микроскопа. Различают несколько типов конденсоров в зависимости от метода наблюдения: конденсор светлого поля, конденсор темного поля, конденсор для наблюдения по методу фазового контраста. Два последних используются для наблюдения за живыми объектами.

Зеркало имеет две поверхности: выпуклую и вогнутую. Вогнутая - для рассеянного света, плоская - для лампы. Зеркало и конденсор предназначены для освещения препарата пучком света, который за тем попадает в объектив, находящейся в гнезде револьвера.

Объектив - это многолинзовая система, наиболее важная составная часть узла микроскопа.

Недостатки / аберрации / объективов:

7

где d - разрешающая способность объектива,

Л - длина волны света применяемого для освещения объекта, N/А - числовая апертура объектива.

При косом освещении объекта разрешающая способность увеличивается вдвое:

d =

Числовая или нумерическая апертура объектива /NA/ характеризует светособирательную способность объектива и определяется по формуле:

NA = n* sinα,

где NA - нумерическая апертура объектива ,

n - показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом , α - половина апертурного угла конуса лучей, выходящего из точки

объекта и ограниченного входящим зрачком объектива.

Чем больше значение нумерической апертуры , тем лучше разрешающая способность объектива .Иммерсионные объективы имеют более высокую нумерическую апертуру , чем сухие , т.к. показатель преломления жидкости больше , чем воздуха .Так показатель преломления воздуха равен 1 , кедровое масло имеет п = 1,515; а вода имеет п=1,33. Наиболее высокая нумерическая апертура у масляно ~ иммерсионных объективов : от 1,25 до 1А.

Пример: Имеются два объектива увеличения х90 со следующими нумерическими апертурами : 1,3 и 1,25 и длиной волны 550.У какого из объективов разрешающая способность больше ?

Упервого объектива d=550/l , 30=0,423 /микрон/.

Увторого объектива d=550/l , 25=0,440/микрон/.

Следовательно , разрешающая способность у первого объектива больше .

Значение нумерической апертуры постоянно для объектива и указано на его оправе . Масляно - иммерсионные объективы имеют и буквенные обозначения: МИ, МО и другие и опоясаны темной полоской . Белой полоской опоясаны водная иммерсия.

На объективе указано также увеличение х8 , х40 , х90 .

Окуляр строит мнимое изображение .увеличивает его , не выявляя новых подробностей, строения .Существуют окуляры Гюйгенса ,

8

предназначенные для работ с ахроматами малых и средних увеличений и планрхроматами малых увеличений . При работе с апохроматами. , планохроматами , ахроматами больших увеличений используются

изображения . Они используются только в

• тографии в видимой области спектра и применяются с объективами анохроматали.

Наибольшее полезное увеличение , получаемое в микроскопе не должно превышать 1000 NA .

1ример. Объектив х90 , NA =1,250. Какое должно быть максимально лезное увеличение ? Ответ: не более 1250 .

Разделив данное увеличение на 90 , получаем увеличение для окуляра не лее 13,8 , т.е. 10 или 12 .Если использовать большее увеличение окуляра, изображение будет ухудшаться .

Полное увеличение микроскопа - окуляр + объектив + бинокулярная

.садка.

Окуляры и объективы ввинченные в револьверное устройство крепятся на бусе . Обычно работают с наклонным тубусом , но для микрофотографирования применяется прямой тубус .

Увеличение бинокулярной насадки х1,5 . Бинокулярная насадка снабжена диоптрийным устройством . При этом оба поля зрения от двух тубусов насадки должны слиться в одну точку .

Движение препарата на столике микроскопа обеспечивается в двух взаимно перпендикулярных направлениях препаратоводителем . Столик и препаратоводитель снабжены нониусами .

Осветитель состоит из корпуса с патроном для лампы - точечного источника света , трансформатора с реостатом .

Для повышения контрастности исследуемого препарата следует вменять светофильтры дополнительного цвета к окраске изучаемой структуры , которая вследствии этого выглядит черной .Например , для красных структур нужен зеленый фильтр , для синих ~ желтый .

Апертура — это действующее отверстие оптической системы линз или лафрагмы . Для рациональной установки освещения для полного пользования освещения должны совпадать апертура осветителя , объектива и конденсора .

Клеточный митотический цикл .

Под митотическим циклом понимают совокупность взаимосвязанных и хронологически детермированных событий ,

9

происходящих в клетке в период к подготовке к делению а , также на протяжении самого митоза .

В настоящее время предложено разбивать митотический цикл на четыре периода:

1.Собственно митоз/профаза , метофаза , анафаза делофаза/. 2.Пресинтетический период /Y1/.

3.Период синтеза ДНК/8/.

4.Постсинтетический период/Y2/.

Три последние периода представляют собой интерфазу . Интерфаза . Ядро в клетке округлое с четкими границами . В нем

видны одно или два ядрышка . Хроматин в виде глыбок заполняет кариоплазму .

Профаза. Ядро в клетке увеличивается, в нём исчезают ядрышки. В кариоплазме наблюдается как бы клубок составленный из тонких нитей. Это хромосомы. В конце профазы оболочка ядра разрушается и хромосомы выходят в цитоплазму.

Метафаза. Хромосомы заметно укорачиваются, приобретая вид сильно изогнутых палочковидных структур. Постарайтесь найти клетку, в которой хромосомы лежат в экваториальной плоскости, образуя звезду.

Анафаза. Сестринскины хромосомы перемещаются к полюсам - поэтому в клетке можно увидеть фигуры, напоминающие две звезды. Обратите внимание, что хромосомы имеют вид шпильки. Центромеры направлены к полюсам, а плечи расходятся под углом друг к другу.

Телофаза. У противоположных полюсов, клетки видны рыхлые клубки из частично деспирализованных хромосом. В центре клетки начинает формироваться перегородка, которая постепенно делит материнскую клетку на две дочерниных.

Зарисуйте клетки на различных стадиях митоза и в интерфазе. На рисунке должны быть обозначены: - интерфаза /ядро, цитоплазма, хроматин/;

- профаза/хромосомы/'; -метафаза /материнская звезда/; -анафаза /дочерние звезды/; -телофаза/ядра дочерних звезд/.

Часто при эколого-цитологических работах необходимо учитывать уровень митотической активности исследуемой ткани. Чтобы вычислить уровень митотической активности ткани вычисляют соотношение числа клеток, находящихся в митозе к общему числу

10

клеток исследуемой ткани, т.е. определяют митотический индекс /М1/. Выражается митотический индекс в промиллях тысячных долях целого.

На основании подсчета количество клеток, находящихся в каждой стадии митоза определяется относительная длительность профазы, метафазы и анафазы, телофазы в процентах к общему количеству делящихся клеток.

Подсчет клеток на разных фазах митотического цикла приводят в нескольких полях зрения. Во избежание попадания на одно и тоже поле, препарат передвигается последовательно через одно поле зрения к другому вначале сверху вниз до конца препарата, затем через одно поле в сторону снизу вверх.

Митотический индекс определяется на основе просмотра 1000 клеток. Данные по подсчету заносятся в таблицу, включающую все стадии, и затем суммируются.

Митотический индекс определяется по формуле:

М1/П + М»А+.Т/»10РО *

1 '1 ~ общее количество просмотрена клеток 7

где MI-митотический индекс,

ГГ, М, А, Т- количество клеток, находящихся соответственно в профазе, метафазе, анафазе, телофазе;

1000 - переводной коэффициент.

Определение относительной длительности митоза определяется по формуле:

9 1 П*-М-нД + ТУ

где П, М, А, Т - число клеток в стадии соответственно в профазы, метофааы, анафазы, телофазы;

100<«— переводной коэффициент.

Ход работы.

1 .Ознакомьтесь на практике со световым микроскопом, его устройством и принципами действия.