2966

Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования

«Нижегородский государственный архитектурно-строительный университет»

В.Б.Темнухин

МИКРОБИОЛОГИЯ, МОНИТОРИНГ И МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

Учебно-методическое пособие по выполнению лабораторных работ для обучающихся

по дисциплине «Микробиология, мониторинг и методы контроля» направлению подготовки 05.03.06 Экология и природопользование профиль Природопользование

Нижний Новгород, 2016

3

УДК 577.1

Темнухин В.Б./ Микробиология, мониторинг и методы контроля

[Электронный ресурс]: учеб.-метод. пос. / В.Б.Темнухин; Нижегор. гос. архитектур. - строит. ун - т – Н. Новгород: ННГАСУ, 2016. – __ с.– 1 электрон. опт. диск (CD-RW)

Методические указания предназначены для выполнения студентами ННГАСУ лабораторных работ по дисциплине «Микробиология, мониторинг и методы контроля» направлению подготовки 05.03.06 «Экология и природопользование» профиля «Природопользование». Работы позволяют полнее усвоить содержание лекционного курса, регламентированного учебной программой, с учетом технических возможностей кафедры экологии и природопользования. Выполнение многих из работ можно организовать в форме научного исследования. Материалы указаний помогают студентам четко формулировать задачи и выбирать способы их решения, а также приобретать умение проводить эксперимент и объяснять его результаты.

© Темнухин В.Б., 2016

© ННГАСУ, 2016

4

Правила техники безопасности в микробиологической лаборатории

Микробиологическая лаборатория, представляет комплекс помещений, приборов и оборудования, позволяющих проводить комплексные экологические исследования микроорганизмов различных сред обитания. Нахождение в микробиологической лаборатории требует соблюдения правил работы

и техники безопасности, основные из которых приведены ниже.

1.Работа в лаборатории разрешается только в специальной одежде (халат и белая шапочка). Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

2.Запрещается выходить за пределы лаборатории в рабочих халатах или надевать поверх халата верхнюю одежду.

3.В помещении лаборатории запрещается курить и принимать пищу.

4.Весь поступающий в лабораторию материал должен рассматриваться как инфицированный патогенными микроорганизмами.

5.Исследуемый материал помещают в специальные кюветы или на специальные подносы.

6.Переливание жидкостей, содержащих микроорганизмы, допускается только над сосудом, содержащим дезинфицирующий раствор.

7.О случаях пролива инфекционного материала необходимо немедленно сообщать преподавателю. Дезинфицировать загрязненное место немедленно.

8.Соблюдать общепринятые приемы, исключающие соприкосновение рук с заразным материалом.

9.Зараженный материал и ненужные культуры уничтожают в день проведения эксперимента. Инструменты стерилизуют и дезинфицируют.

10.Металлические предметы после каждого соприкосновения с культурами прожигают в пламени спиртовки.

11.Помещение убирают с применением дезинфицирующих средств и после уборки в нем включают бактерицидную лампу на 30 минут.

12.По окончании работ дезинфицируют руки и приводят в порядок рабочее место. Для дезинфекции можно применять следующие растворы:

13.1-3% раствор хлорамина, 3-5 % раствор фенола (карболовая кислота), 70% этиловый спирт, 2-3% раствор соды (бикарбонат натрия);

Рабочее место и обработка лабораторной посуды

В микробиологических исследованиях для достижения точных результатов необходимо исключить возможность попадания посторонних микроорганизмов из «окружающей среды в лабораторную посуду и питательные среды. Это достигается путем стерилизации. Стерилизации подлежат вся посуда для микробиологических анализов и расходные материалы (вода, физиологические растворы, питательные среды, вата, марля, нитки и т.д.).

Стерилизация - полное уничтожение всех, вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов. Различают несколько способов стерилизации:

1.Фламбированиё (обжигание) - этим способом стерилизуют небольшие стеклянные (палочки, шпатель) и металлические предметы (пинцет, скальпель, петли, иглы). Предметы проводят несколько раз через пламя спиртовки. Стерилизация достигается обугливанием находящихся на их поверхности микроорганизмов.

2.Кипячение - как правило, этим способом стерилизуют металлические инструменты и резиновые трубки. Рекомендуется кипячение проводить в 2% растворе карбоната натрия.

3.Сухой жар - используют при стерилизации стеклянной посуды. Подготовленную к стерилизации посуду помещают в сушильный шкаф и нагревают при температуре 160° С в течении 2 часов.

4.Пар (текучий пар) - используют при стерилизаций питательных сред, резиновых трубок и других предметов, неустойчивых к воздействию сухого жара. Проводят в автоклаве при открытом вентиле

5

30-45 минут при 100° С.

5.Фильтрация (холодная стерилизация) - осуществляется с помощью стерильных мелкопористых бактериальных фильтров Na 1-5, имеющих средний диаметр пор от 0,3 до 1,2 мкм.

6.Стерилизация в автоклаве под давлением - наиболее надежный способ стерилизации питательных сред и материалов. Полная стерилизация питательных сред при 120° С и давлении 1 атм. обеспечивается нагреванием в течение 20 минут.

Кметодам стерилизации относят также пастеризацию и тиндализацию. Пастеризация - частичная стерилизация - проводится в печах Пастера. Пастеризация заключается в нагревании различных продуктов до температуры 70-75° С в течение 30 минут. При этом уничтожаются только неспороносные бактерии при сохранении качества продуктов. Тиндализация - дробная стерилизация

-предложена Тиндалем для уничтожения споровых бактерий и для стерилизации веществ, легко разлагающихся при температуре выше 60° С. Нагревание производят повторно в течение 5-6 дней при 58° С с последующей выдержкой в термостате при 37* С • в течение ночи (тиндализация может проводиться также в автоклавах текучим паром).

Выбор конкретного способа стерилизации зависит от состава микрофлоры объекта, подвергаемого стерилизации.

Перед стерилизацией посуду для микробиологического анализа моют и сушат. Новую посуду моют хромовой смесью. Споласкивают несколько раз горячей водой, а затем дистиллированной и сушат в сушильном шкафу при 105° С. Посуду, бывшую в употреблении, необходимо дезинфицировать в 1% растворе хлорамина. Затем эту посуду моют в горячей воде с мылом. Посуду со следами агар-агара заливают 2-5% раствором щелочи (на 1 сутки). Посуду, сильно загрязненную жирами, моют хромовой смесью. Лабораторную посуду, используемую для хранения и приготовления питательных сред, нельзя мыть дезинфицирующими веществами (хлорамином). Градуированные пипетки моют в мыльном растворе. Затем их нейтрализуют 1-2% раствором соляной кислоты. Бывшие в употреблении пипетки прочищают механически. Затем их кипятят в мыльном растворе в течение 20-30 минут и ополаскивают. Пипетки, загрязненные жирными веществами, моют также хромовой смесью. Новые предметные и покровные стекла моют в мыльной воде и заливают смесью Никифорова (спирт - эфир) на 2-3 дня. Если жирные пятна остаются, то стекла заливают 5% раствором гидроксида натрия и кипятят 20-30 минут. После кипячения в щелочи предметные, и покровные стекла нейтрализуют 10-15 минут в 5-10% соляной кислоты и промывают проточной водой. Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, выдерживают 2-3 часа в хромовой смеси. Затем заливают стекла 5% раствором щелочи и кипятят 30-40 минут. Вымытая посуда не должна иметь налет или пятна. Для этого посуду ополаскивают дистиллированной водой и сушат в сушильном шкафу при 105° С. По окончании работ дезинфекцию рук проводят 1% раствором хлорамина.

В вузах не разрешается работать с живыми патогенными микроорганизмами. С этой группой студенты знакомятся путем демонстрации готовых фиксированных препаратов, полученных в специальных медицинских лабораториях. Однако работа с сапрофитными формами микроорганизмов также требует соблюдения абсолютной стерильности.

Лабораторная работа № 1

Приготовление питательных сред

Пояснения. Для жизнедеятельности микроорганизма необходимо постоянное поступление питательных веществ в микробную клетку. Поэтому для выращивания (культивирования) прокариот используются питательные среды, учитывающие физиологические потребности конкретного микроорганизма. Питательная среда содержит все вещества, необходимые для роста и размножения (макро- и микроэлементы, а также факторы роста), имеет оптимальную вязкость, влажность, pH, окислительно-восстановительный потенциал. Питательная среда должна быть стерильной. Наиболее широкое применение находят так называемые стандартные среды: мясопептонный бульон (МПБ),

6

мясопептонный агар (МПА), мясопептонная желатина (МПЖ), сусло-агар (СА). Мясные среды используют для культивирования бактерий» а сусловые - для грибов. По назначению питательные среды разделяют на стандартные, элективные, дифференциально-диагностические. Стандартные питательные среды подходят для нескольких разновидностей микроорганизмов (например, МПА, МПБ). Элективные среды используются для выращивания отдельных видов или физиологических групп микроорганизмов, а также определения структуры популяций микроорганизмов. Эти среды пригодны лишь для конкретного вида микроорганизмов и малопригодны, или непригодны, для большинства других видов. Это связано с тем, что составы сред отличаются друг от друга по лимитирующим энергетическим компонентам, играющим важную роль в метаболизме той или иной группы прокариотов. С помощью метода элективных питательных сред можно успешно контролировать функциональную активность микробиоцинозов сточных вод, то есть тех, групп микроорганизмов, которые играют важную роль в очистке промстоков (аммонифицирующие, нитрифицирующие, углеводородокисляющие бактерии).

Дифференциально-диагностические среды применяются для изучения биохимических свойств микроорганизмов и для выделения чистых культур (пример - среда Эндо для выделения кишечной палочки).

По происхождению различают естественные и искусственные питательные среды 1 Искусственными питательными средами называют среды, полученные из мясных или растительных экстрактов с добавлением неорганических солей я азотистых веществ. По консистенции различают следующие разновидности питательных сред: плотные (МПА, картофель), жидкие (МПБ, молоко), полужидкие (с добавлением 0,25% агара), сыпучие (сухие).

Цель работы: приобретение навыков приготовления питательных сред, предназначенных для выделения, культивирования я идентификация микроорганизмов.

Ход работы:

Приготовление мясопептонного бульона (МПБ) (для выявления гетеротрофных микроорганизмов)

На жидкой среде МПБ развивается большинство гетеротрофных микроорганизмов. Готовый бульон должен быть абсолютно прозрачным, янтарно-желтого цвета. К 1 литру мясной воды прибавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия и нагревают до полного растворения пептона и соли. Затем устанавливают pH (pH должен находиться в пределах 7.2-7.4). Затем питательную среду осветляют не фильтруют, затем разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при Т=120° С.

Приготовление мясопептонного агара (МПА)

(для выявления гетеротрофных микроорганизмов)

МПА - универсальная плотная питательная среда, которая плавится при температуре около 100° С. На МПА может развиваться большинство гетеротрофных микроорганизмов. Исходной средой для приготовления МПА является МПБ. К готовому МПБ добавляют 2 % агара и нагревают до полного растворения агара. Горячую среду нейтрализуют 10% раствором соды до слабощелочной реакции (pH должен быть в пределах 7,2-7,4), фильтруют в горячем виде через -складчатый фильтр, разливают по колбам с ватными пробками и стерилизуют при1 атм 20 минут.

Приготовление индикаторной среды Стровиннского (для выявления псевдомонад)

Псевдомонады можно выявить с помощью питательной среды следующего состава: сульфат магния семиводный - 0,5 г; гипофосфат натрия - 1,0 г; гипофосфат калия - 0,5 г; нитрат аммония - 2,5

7

г; хлорид кальция - 0,05 г; сульфат железа семиводный - 0,05 г; лактоза - 20 г; тимоловый синий - 0,05 г; микроэлементы - следы; агар-агар - 20 г. вода дистиллированная - 1000 мл; pH среды -7,2. Вокруг колоний Pseudomonas образуются синие зоны вследствие перехода индикатора в щелочную форму.

Приготовление индикаторной среды Эндо (для выявления энтеробактерий)

При посеве на агаризованную среду Эндо клетки кишечной палочки дают специфически окрашенные колонии. Состав среды Эндо следующий: мясной экстракт - 5 г; пептон - 10 г, хлористый натрий - 5 г; лактоза - 5 г; сульфат натрия безводный - 5 г; основной фуксин - 0,4 п агарагар - 20 г, водопроводная вода - до 1000 мл.

Приготовление среды Виноградского (для определения нитрифицирующей активности)

Первый этап процесса нитрификации заключается в окислении аммиака до азотистой кислоты.

Этот процесс ведут нитрозные бактерии: Nitrosomonas, Nitrosolobus, Nitrosococcus, Nitrosospira.

Вторая фаза нитрификации заключается в окислении азотистой кислоты до азотистой. Этот процесс ведут нитратные бактерии Nitrobacter, Nitrospira.

Для выявления нитрифицирующих бактерий используется среда Виноградского, содержащая для 1 фазы нитрификации: сульфат аммония - 2 г; гипофосфат калия - 1 г; сульфат магния - 0,5 г; хлорид натрия - 2 г; сульфат железа семиводный - 0,1 г; карбонат кальция - 5 г; дистиллированная вода - 1000 мл; для второй фазы нитрификации: нитрат натрия - 1 г; карбонат натрия безводный - 1 г; хлорид натрия - 0,5 г; гипофосфат кадия - 0,5 г; сульфат магния -3 г; сульфат железа - 0,4 г; вода дистиллированная - 1000 мл.

Приготовление среды Гильтая (для определения денитрифицирующей активности)

Процесс восстановления нитратов и нитритов с образованием молекулярного азота, который ведут микроорганизмы, получил название прямой денитрификации. Денитрификация ведет к потере запасов азота в почве и расценивается как процесс вредный для сельского хозяйства.

Денитрифицирующую активность бактерий легко выявить на среде с нитратами, содержащей: нитрат калия - 1 г; аспарагин - 1 г, лимонная кислота - 5 г; гипофосфаткалия - 1 г, сульфат магния - I г; хлорид кальция - 0,2 г; хлорид железа следы - следы, вода - 1000 мл.

Среда Сорокина (для определения сульфатредуцирующих бактерий)

Восстановление сульфатов до сероводорода ведут сульфатредуцирующие бактерии рода Desulfovibrio. Для выявления десульфатирующих бактерий используются среды Таусона, Штурма, а также Сорокина. Среда Сорокина состоит из гипофосфатакалия - 0,5 г; двух водного гипофосфатанатарнх - 0,3 п сульфата натрия - 0,5; семиводного сульфата магния - 0,1 г; сульфата аммония - 0,2 п соль Мора - 1,0 г; молочнокислый кальций - 2,0 г; вода водопроводная - 50 мл; агарагар - 8 т.

Колонии сульфатредуцирующих микроорганизмов окрашены в черный цвет, также выделяется характерный запах сероводорода.

Культивирование:

1.Посуду для культивирования вымыть, заткнуть плотной ватной пробкой из крафт-бумаги или кальки, горлышки обвязать бумажными колпачками.

2.Посуда должна быть сухой и завёрнутой в бумагу.

8

3.Стерилизовать посуду в автоклаве в течении 15-20 минут при давлении 1 атм. Или в сушильном шкафу при температуре 150оС в течении двух часов.

4.Приготовить среду:

а) Сусло-агар: 200 мл. неохмелённого пивного сусла развести в 400 мл. воды; 20 г. агар-агара расплавить в 400 мл. воды, слегка охладить и смешать с раствором сусла. Сахаристость пивного сусла должна быть не более 4 баллингов, так как грибы не терпят более высоких значений; обычно на пивоваренном производстве используется сахаристость 7 баллингов. Для нужной сахаристости разбавить раствор дистиллированной водой.

б) Картофельно-глюкозный агар: 200 г. очищенного и нарезанного картофеля кипятить в 500 мл. воды в течение двух часов; расплавить 17 г. агар-агара в 500 мл. воды; отвар картофеля процедить в агар и добавить 20 г. глюкозы.

в) Овсяный агар:

75 г. овсяной муки медленно нагреть в течение часа в 500 мл. воды на водяной бане; 17 г. агарагара расплавить в 500 мл. воды и смешать с процеженным овсяном отваре.

г) Среда Чапека:

В500 мл. дистиллированной воды растворить 2 г. NaNO3, 0,5 г. KCl, 1г. K2HPO4, 0,01 г. FeSO4 * 7H2O,0,5 г. MgSO4 * 7H2O , 30 г. сахарозы.

В500 мл. дистиллированной воды расплавляют 20 г. агар-агара и соединяют его с растворами солей.

5.Готовую среду стерилизовать в автоклаве при 1 атм. 15-20 минут. Перед этим проверить кислотность среды. Должно быть pH=6.

6.После стерилизации слегка охладить, разлить в стерильные пробирки и в чашки Петри.

7.Добавить в среду антибиотики 200 ЕД пенициллина, 100 ЕД стрептомицина, 25-50 ЕД тетрациклина на 1 мл. среды.

Лабораторная работа № 2

Микроскопирование плесени

Пояснение. Основным этапом микробиологического исследования является микроскопирование препаратов. Качественное микроскопирование препарата возможно лишь при хорошем освещении. При изучении микроорганизмов пользуются иммерсионным объективом. Это позволяет добиться высокой разрешающей способности и увеличения в 900 - 1350 раз. Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового масла, нанесенного на препарат. Показатель преломления кедрового масла близок к показателю преломления стекла. Благодаря этому лучи света, не преломляясь, попадают в объектив и обеспечивают хорошую видимость.

Приготовление прижизненного (временного) препарата микроорганизма.

На сухое чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды. Затем берут стерильной петлей из пробирки каплю исследуемой культуры и вносят ее в каплю воды, перемешивая. После этого каплю бактериальной взвеси накрывают покровным стеклом и готовый препарат рассматривают с большим увеличением под микроскопом.

Цель работы: Ознакомится с методикой приготовления временных препаратов. Рассмотреть образцы плесени, их строение, определить макро - и микропризнаки.

Материалы и оборудование: микроскоп BIOAM ЛОМО, препоравальные иглы, скальпель, капельница с дистиллированной водой, чашка Петри, покровные и предметные стёкла.

Ход работы: На чистое предметное стекло наносят каплю стерильной воды. В нее вносят небольшое количество исследуемого образца и тщательно смешивают до получения равномерной суспензии. Каплю покрывают сверху покровным стеклом и просматривают под микроскопом с

9

помощью объектива 40х и окуляра 15х. Метод применяют для рассмотрения крупных клеток (дрожжей, плесеней), а также для обнаружения подвижных форм микроорганизмов.

Следует определить макропризнаки образца: цвет, структуру, запах, консистенцию, а так же его микропризнаки: наличие гиф, толщина гиф, степень септирования, наличие пряжек, наличие септ, наличие спор, форма спор. Проанализировать эти данные, занести в таблицы 2.1 и 2.2 и зарисовать.

В выводе рекомендуется указать различия образцов по макропризнакам.

Лабораторная работа № 3

Микроскопирование плодовых тел дереворазрушающих грибов

Цель работы: изучить морфологию дереворазрушающих грибов.

Материалы и оборудование: предметные и покровные стекла, препоравальные иглы, микробиологическая петля, микроскоп.

Ход работы: Изучаются пояснения к лабораторной работе №2.

Затем берётся срез образца древесины, поражённого грибом и не поражённый срез соответственно. Образцы сравниваются под микроскопом.

Препарирование и микроскопирование плодовых тел. Гименофор (спороносный слой) :

1.Сделать поперечный срез плодового тела

2.Перенести срез на предметное стекло и добавить каплю 5% щёлочи (KOH или NaOH) .

3.Закрыть покровным стеклом и рассмотреть срез, измерить величины микрометром.

4.При большом увеличении добавить растительного масла

Для оболочек спор сыроежковых (раствор Мальцера):

1.В 1,5 г. йодистого калия добавить 20 мл. дистиллированной воды.

2.Добавить 0,5 мл. йода и 20 г. хлоралгидрата.

Окраска спор - синяя

Для клетчатки (фиолетовая окраска) хлорцинк:

1.В 30 г. хлористого цинка добавить 14 мл. дистиллированной воды.

2.Добавить 5 г. йодистого калия и 1г. кристаллического йода.

На гликоген раствор Люголя (фиолетовая окраска):

1.В 2 г. йодистого калия добавить 300 мл. дистиллированной воды.

2.Добавить 1 г. кристаллического йода.

10

На млечные ходы и цистиды:

Сульфованилин (1-2 кристаллика ванилина на 1 каплю концентрированной H2SO4)

На базидии:

Для демонстрации на бумагу: в 200 г. кипятка добавить 15-20 г. желатина или агар-агара и 2-3 капли концентрированного раствора карболовой кислоты.

Таблица 3. 1 Анализ морфологии дереворазрушающего гриба по макропризнакам

Виды под микроскопом зарисовать. Данные занести в таблицу 3.1 и 3.2. В выводе рекомендуется написать разнице повреждённых грибом клеток древесины и неповреждённых, если таковая имеется.

Лабораторная работа № 4

Микрокопирование водорослей, дрожжей

Цель работы: изучить морфологию водорослей, дрожжей.

Материалы и оборудование: предметные и покровные стекла, препоравальные иглы, микробиологическая петля, микроскоп.

Ход работы: На сухое чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды. Затем берут стерильной препаровальной иглой или микробиологической петлей с образца исследуемую культуру и вносят ее в каплю воды. После этого накрывают покровным стеклом, и готовый препарат рассматривают под микроскопом.

Следует определить макропризнаки образца: цвет, структура, запах, консистенция, а так же его микропризнаки: наличие гиф, толщина гиф, степень септирования, наличие пряжек, наличие септ, наличие спор, форма спор. Проанализировать эти данные, занести в таблицу 4.1 и 4.2, зарисовать.

В выводе рекомендуется указать различия образцов по макропризнакам.

Таблица 4. 1 Анализ морфологии водорослей, дрожжей по макропризнакам