1. Классификация иммунохимических методов. Основные этапы.

Выделяют следующие виды иммунохимического анализа:

Название метода	Способ детектирования
Радиоиммунный анализ  (РИА)	Радиоактивность
Иммуноферментный анализ  (ИФА)	Ферментная активность
Поляризационный флуороиммуноанализ  (ПФИА)	Интенсивность флуоресцентной поляризации
Люминесцентный иммуноанализ  (ЛИА)	Интенсивность люминесценции

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал

Все методы иммунохимического исследования включают 4 этапа. 1 этап. Нанесение метки на препарат или его аналог. 2 этап. Добавление антисыворотки с антителами и образование комплекса антитело­меченый препарат. 3 этап. Добавление исследуемой крови  (сыворотки) или мочи. Происходит вытесне­ние анализируемым веществом меченого препарата из комплекса и образование нового комплекса: анализируемое вещество-антитело. 4 этап. Измерение радиоактивности, интенсивности флуоресценции, активности фер­мента и т.д.

Метод	Способ детектирования
Иммуноферментный анализ (ИФА)	Ферментная активность
Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ (ФПИА)	Интенсивность флуоресцентной поляризации
Радиоиммунный анализ (РИА)	Радиоактивность
Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА)	Интенсивность люминесценции
Иммуносенсорные методы	Электрический сигнал
Спин-иммунологический анализ (СИА)	Электронный спин-резонанс сво-бодных радикалов
Металлоиммуноанализ (МИА)	Атомарные спектры поглощения
Нефелометрические иммунометоды	Преломление света

2. Основные преимущества ихм. Типы применяемых меток и способы их детектирования.

В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела – это белки класса иммуноглобулинов, которые вырабатываются в имунной системе в результате проявления защитной функции (иммунитета) при попадании в организм чужеродного вещества – антигена.

Достоинства метода:

·        Быстрота и простота определения;

·        Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях;

·        Не сложная пробоподготовка;

·        Высокая точность;

·        Не требуется дорогостоящей аппаратуры.

Недостатками можно назвать узкую специфичность и влияние компонентов матрицы.

Метки, используемые в ИХА. В качестве меток в ИХА используются различные вещества и частицы.

• 1. Красители (наночастицы коллоидного золота или углерода или частицы окрашенного латекса). Этот вариант обеспечивает визуальную детекцию результата либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование красящих меток, присоединенных к носителю (частицам латекса), позволяет проводить мультианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Чаще всего используемой меткой является наночастицы коллоидного золота.

• 2. Ковалентно связанные с частицами латекса флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминесцентные метки. Они используются только в приборных вариантах ИХА, где результат регистрируется специальным ридером. Из всех вариантов наиболее распространены флуоресцентные метки.

• 3. Закрепленные на частицах латекса парамагнитные метки. Метод используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.

• 4. Ферментные метки, которые используются по принципу И ФА. Реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов. Результат анализа является визуальным или считывается с помощью ридера.

• 5. Липосомы, которые используются в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, элек- троактивных и пр.). Это новое направление в разработке различных разновидностей ИХА

3. Радиоиммунный анализ

Радиоиммунологический метод (РИА; син. радиоиммунологический анализ) — основанный на реакции антиген—антитело метод количественного определения биологически активных соединений, обладающих антигенными свойствами, и антигенов микроорганизмов с помощью аналогичных известных антигенов или антител, меченных радиоактивным изотопом. Радиоиммунологический метод позволяет количественно определять в жидкостях организма (сыворотка крови, моча и др.) содержание гормонов и различных антигенов, в т. ч. антигенов микроорганизмов. Основным достоинством Радиоиммунологического метода является его очень высокая чувствительность благодаря использованию изотопной метки антигенов (или антител) и применения сывороток с высоким сродством и специфичностью антител (см.).

Становление и развитие Радиоиммунологического метода связано с работой Ялоу и Берсона (R. S. Yalow, S. A. Berson, I960), предложивших этот метод для определения эндогенного инсулина в плазме крови.

Сущность Р. м. состоит в использовании для определения антигенов (см.) соответствующих иммунных сывороток и введении в систему антиген — антитело антигена, меченного радиоактивным изотопом, напр, йода (125I), в результате чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Т. к. меченый антиген добавляется в определенной дозе, то можно определить, какая его часть связалась с антителами, а какая часть осталась несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. При определенных концентрациях количество меченого антигена, связавшегося с антителами, обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Схематически этот процесс можно изобразить следующим образом:

После взаимодействия антигенов с антителами образовавшиеся комплексы антиген—антитело (см. Антиген-антитело реакция) отделяют от свободного меченого антигена. Отделение комплекса антиген—антитело производят различными способами: с помощью электрофореза (см.), гель-фильтрации (см.), фракционного осаждения иммунного комплекса этанолом, сульфатом аммония и др., а также с помощью агрегации иммунных комплексов антиглобулиновой сывороткой или сорбции их на иммобилизованных (прикрепленных к поверхности твердой фазы) антителах. Кроме этого, возможна сорбция свободного меченого антигена с помощью добавленных веществ, напр, талька, целлюлозы, кварца, активированного угля и др. Отделив меченый несвязанный антиген от комплекса антиген— антитело, определяют количество меченого антигена, связавшегося в комплексе но количеству импульсов (с помощью сцинтилляционного счетчика). Снижение количества импульсов в единицу времени в сравнении с соответствующими контролями свидетельствует о присутствии гомологичного меченого антигена, связанного с анти-сывороткой, в результате чего меченый антиген не вступил в реакцию и не определяется в комплексе антиген— антитело.

Иммунную сыворотку против определяемого антигена и меченого антигена предварительно оттитровывают и используют в Р. м. в оптимальном разведении, при к-ром происходит связывание 50% внесенной метки. Для оценки результатов применяют данные (график) зависимости связывания меченого антигена сывороткой в оптимальном разведении от концентрации меченого (стандартного) антигена.

4. Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (ИФА) — один из видов иммунохимического анализа. Он основан на высокоспецифической иммунологической реакции антигена (АГ) с соответствующим антителом (АТ) с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. Стадия узнавания исследуемого соединения специфическим антителом;

2. Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. Стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

В реакции участвуют:

• Твердая фаза;

• АГ и АТ;

• Конъюгат (антиген или антитело, меченые ферментом);

• Ферментный маркер;

• Субстрат;

• Стоп-реагент (чаще всего применяют серную кислоту).

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Антигены и антитела

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант. Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые АТ могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgG1, IgG2). Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в образцах.

Ферментные маркеры: наибольшее применение нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза.