новая папка 2 / 49969

на правах рукописи

ДОХОВА Залина Лостанбековна

Использование генной технологии для характеристики разводимых пород

крупного рогатого скота в предгорной зоне Северного Кавказа

06.02.07 - разведение, селекция, генетика сельскохозяйственных животных

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования (повышения квалификации) специалистов Российской академии менеджмента в животноводстве

(ФГБОУ РАМЖ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Марзанов Нурбий Сафарбиевич

Официальные оппоненты:

Скрипниченко Георгий Григорьевич

доктор биологических наук, профессор кафедры генетики и разведения животных ФГБОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина

Лозовая Галина Степановна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории разведения красно-пестрой породы скота ФГБНУ ВНИИплем МСХ РФ

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кабардино-Балкарский государственный аграрный университет имени В.М. Кокова» (ФГБОУ ВПО КБГАУ).

Защита диссертации состоится "_25_"_июня__ 2013 г. в "_10_" часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.03 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.

Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина.

Тел.: 8(495) – 377 – 49 – 39; Факс: 8(495) 377 – 49 – 39.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан "_24_"__мая____ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Шумилина

Наталья Николаевна

1

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Исходя из фундаментальной идеи французского

историка XX века Фернана Броделя о существовании «островов цивилизаций, окруженных сушей» (Бродель Ф., 2002; Агрба Б.С., Хотко С.Х., 2004), животноводство России рассматривается как крупная социальнобиологическая структура, состоящая из разных историко-культурных самобытностей. В научной практике подобная попытка еще никем не предпринималась, хотя в специальной литературе немало материалов об особенностях животноводства разных регионов Российской Федерации [Марзанов Н.С., 2010].

Что понимается под «островами цивилизаций, окруженных сушей»? Исторический аспект хорошо видимых неповторимых своеобразий, свой, ни с чем несравнимый региональный аромат, в высшей степени самобытный. Это касается элементов не только животноводства, но и всей сельскохозяйственной отрасли. Такими островами на территории Российской Федерации являются Северный Кавказ, Верхне-Волжский район, Забайкалье, Тундровая зона, Республика Тыва, Республика Саха-Якутия, Алтай.

В условиях разведения животных бурой швицкой породы, к которым относится Северный Кавказ и в частности Кабардино-Балкарская Республика (КБР), в силу исторических обстоятельств, сложившихся в данном регионе, желательным является молочно-мясной тип крупного рогатого скота с высокими сыродельческими свойствами молока. Учитывая, что у кавказских народов накоплен огромный опыт по использованию молока в своей жизнедеятельности, считаем необходимым провести оценку влияния генетики животных на такой важный продукт, как адыгейский сыр.

Генетическое маркирование дает возможность сравнивать популяции по уровню биоразнообразия, проводить мониторинг генофонда породы, анализировать степень внутренней их дифференциации, оценивать линии и семейства, прогнозировать эффективность племенной работы, успешно применять в виде метчиков качественных и количественных признаков, судить о формообразовательных процессах, происходящих в организме животных. В молочном скотоводстве все большее значение приобретает генетическая оценка особей, типов и пород с использованием различных маркеров, включая полиморфные системы белков, группы крови и последовательности ДНК, оценка их связи с различными типами молочной продукции (Машуров А.М., 1980; Амерханов Х.А., Марзанов Н.С., 1999; Амбросьева Е.Д., 2005; Марзанов Н.С. и др., 2003, 2004, 2006, 2010; Хаертдинов Р.А. и др., 2009; Калашникова Л., 2010).

Цель и задачи исследований. Целью работы явилась оценка семени племенных быков, принадлежащих ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям, по двум наследственным заболеваниям (BLAD, CVM) и каппа-казеину. Характеристика коров бурой швицкой породы племрепродуктора СХПК «Верхнемалкинский» КБР по трем типам генетических маркеров (группы крови, полиморфные белки и ДНК

2

последовательности) и их связь с технологическими свойствами молока. В связи с этим решали следующие задачи:

1. Дать характеристику племенным быкам ОАО «КабардиноБалкарское» по воспроизводству и биотехнологиям, на основе результатов анализа носительства мутантных BL и CV аллелей, вариантов каппа-казеина

сучетом породы и генеалогического корня.

2.Изучить генофонд бурого швицкого скота СХПК «Верхнемалкинский» по трем типам генетических маркеров: группам крови, полиморфным белкам и каппа-казеину.

3.Дать иммунологическую и генетическую характеристику исследованной популяции коров бурой швицкой породы по ЕАВ локусу групп крови.

4.Провести анализ полиморфных систем белков крови (гемоглобин, трансферрин, альбумин, преальбумин) у коров бурой швицкой породы.

5.Изучить генетическую структуру у коров бурой швицкой породы по локусу каппа-казеина, гормона роста и пролактина.

6.Дать характеристику молочной продуктивности коров СХПК «Верхнемалкинский» с учетом генотипа по каппа-казеину.

7.Изготовить и провести оценку качества адыгейского сыра из молока коров бурой швицкой породы с учетом генотипа по каппа-казеину.

Научная новизна. Впервые на основе популяционно-генетического анализа по 10 системам групп крови определена частота встречаемости антигенов, аллелей и генотипов у коров бурой швицкой породы. Показано у животных наличие аллелей костромской и кавказской бурой пород. Проведен генетический анализ по четырем полиморфным локусам белков: гемоглобину (HB), трансферрину (TF), альбумину (ALB), преальбумину (PRE). Предложена классификация аллелей в полиморфных локусах маркирующих систем. По коэффициенту эксцесса установлен высокий уровень гетерозиготности у коров бурой швицкой породы. Установлено, что генетические системы трех типов (группы крови, полиморфные белки и ДНК маркеры) являются эффективным инструментом для популяционногенетической характеристики бурой швицкой породы, разводимой в условиях КБР.

Теоретическая и практическая значимость работы. Впервые получены данные для характеристики аллелофонда животных бурой швицкой породы. Показана встречаемость аллелей трех типов маркирующих систем у пород быков и коров бурой швицкой породы. У исследованных

3

сыре был также выше в молоке коров с CNВВ генотипом. У исследованных быков голштинской породы по двум наследственным заболеваниям выявлен один носитель с BL мутацией. У всех исследованных животных отсутствовал рецессивный CV аллель. Отсутствуют ассоциации между генотипами по каппа-казеину и уровнем гомозиготности других маркирующих систем; между уровнем гомозиготности групп крови, полиморфных локусов, пролактина и гормона роста и продуктивными признаками. Это говорит о том, что на формирование качества сыра влияет структура В варианта белка каппа-казеина и связанных с ней систем в молоке.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и одобрены на ученых советах ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии и ФГБОУ РАМЖ (20092012). Часть материалов диссертации были представлены в научных трудах ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии: «Научные основы ведения животноводства» (Дубровицы, 2009); в материалах Всероссийской научно-практической конференции на тему: «Научное обеспечение АПК Евро-Северо-Востока России» (Саранск, 2010); в трудах научно-практической конференции «Практическое использование современных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота» (Быково, 2011); в материалах международной научно-практической конференции на тему: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (Быково, 2012).

Публикации. По теме диссертации издано 7 научных работ, из них две в рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ журналах (Доклады РАСХН, 2011. №3; Проблемы биологии продуктивных животных, 2011. №4).

Основные положения, выносимые на защиту:

-характеристика семени племенных быков по трем типам генетических маркеров и носительства мутантных BL и CV аллелей;

-оценка аллелофонда у коров бурой швицкой породы по группам крови, полиморфным локусам и ДНК-маркерам;

-оценка продуктивности и качества молока и адыгейского сыра, полученного от коров с различными генотипами по каппа-казеину.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических

предложений, библиографии. Материал изложен на 111 страницах компьютерного текста, содержит 17 таблиц, 5 рисунков и одно фото. Библиография включает 135 источников, в том числе 42 - на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили с 2008 по 2012 гг. в двух хозяйствах: ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям и СХПК «Верхнемалкинский» КБР. Всего было исследовано 236 животных, из них 26 племенных быков трех пород (голштинская, бурая швицкая, красная степная) и 210 коров бурой швицкой породы. Работу проводили на

4

основании общей схемы исследований, представленной на рисунке 1. Полученные данные по племенным быкам из КБР сравнивали с результатами исследований других племобъединений: ОАО "Тамбовплем"; ОАО «ГЦВ СЖ»; ОАО "Кировплем".

Материалом для исследований служили образцы семени быков трех пород ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям, а также цельная кровь и молоко лактирующих коров из СХПК «Верхнемалкинский». Кровь брали из яремной вены вместе с ветеринарными специалистами хозяйства. Для получения сывороток, а также изготовления суспензий эритроцитов, кровь отбирали в пробирки с консервантом в соотношении 4:1. После взятия крови производили отделение сыворотки с последующим ее замораживанием в морозильной камере при –20оС до проведения исследований. Характеристику генофонда у коров бурой швицкой породы племрепродуктора «Верхнемалкинский» КБР проводили по 10 системам групп крови (Сороковой П.Ф., 1974).

Образцы молока отбирали во время контрольных доек. Консервацию молока проводили бромополом. Оптимальной дозой считалась 1 таблетка бромопола на 30 мл молока. При проведении эксперимента с целью изготовления адыгейского сыра с учетом генотипов по каппа-казеину были сформированы 4 группы коров по 15 животных в каждой:

«Верхнемалкинский» КБР. После изготовления сыра из молока животных с генотипами по каппа-казеину (κ-CNАА, κ-CNВВ, κ-CNАВ, κ-CNАА+ВВ+АВ),

проводили химический анализ на содержание % влаги, % сухого вещества, % жира в натуральном сыре, % жира в сухом веществе по схеме, предложенной Кугеневым В.В., Барабанщиковым Н.В. (1988). Определение физико-химического состава молока и оценку сыра проводили согласно ГОСТам, в лаборатории компании «Молочный продукт», расположенной в Кабардино-Балкарской Республике (г. Нальчик).

Спермобанк ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям, исследовали по мутантным аллелям двух наследственных заболеваний: дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) и комплекса

аномалий позвоночника (CVM), и трем аллелям каппа-казеина (κ-CNА, κ- CNВ, κ-CNЕ).

Выделение ДНК из крови и спермы, оценка его качества, а также генотипирование аллелей проводили по схеме, предложенный Kantanen J. (1999). Диагностику мутантного аллеля, вызывающего дефицит лейкоцитарной адгезии или BLAD, осуществляли по методике, изложенной в работах Shuster D.E. et al. (1992) и Tammen I. (1994).

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма генов

Ассоциации между генотипами и качеством молока и сыра

Рисунок 1. Общая схема исследований

6

Диагностика мутантного аллеля комплекса аномалий позвоночника (CVM) осуществлялась по методу, описанному Rusc A., Kaminski S. (2007). Определение пролактина (PRL) и гормона роста (GH) проводили соответственно по методикам Mitra A. et al. (1995) и Mohammadabadi M.R. et al. (2010).

Идентификацию вариантов белков крови по локусам гемоглобина (НВ), трансферрина (TF), альбумина (ALB), преальбумина (PRE) осуществляли методом вертикального электрофореза на полиакриламидном геле (Gahne B. et al., 1977; Амбросьева Е.Д., 2005) c некоторыми модификациями (Петров С.Н., 2008).

Изучали следующие популяционно-генетические параметры: частоты аллелей и генотипов исследуемых локусов. Проверку генетического равновесия в изучаемых локусах проводили по формуле: χ2 = Σ Pэмп - Ртеор)2 / Ртеор, где χ2 - критерий соответствия фактического ожидаемому распределению животных по данному генотипу; Рэмп - фактическое число особей данного генотипа в популяции; Ртеор - теоретически ожидаемое число особей данного генотипа. Теоретически ожидаемое число особей определяли по формуле Харди - Вайнберга для двухаллельных систем:N = Np2 + N2pq + Nq2; формуле Бернштейна для полиаллельных систем: N = Np2 + Nq2 + Nr2 + N2pq + N2pr + N2qr. Для характеристики уровня гомо- и гетерозиготности определяли следующие параметры: а). Коэффициент гомозиготности (Са) популяции по формуле Робертсона: Са = где Са - ожидаемая гомозиготность, рi - частоты аллелей в локусе; б). Уровень полиморфности - Na (показатель числа действующих эффективных аллелей) по формуле Робертсона: Na = 1/Ca, где Са - коэффициент гомозиготности; в). Тест гетерозиготности (Т.Г.) по формуле Робертсона: Т.Г. = - отношение числа фактических гетерозигот к числу фактических гомозигот,

- отношение числа теоретических гетерозигот к числу теоретических гомозигот; г). Степень гомозиготности по нескольким локусам (SH) по Гельдерману: SH= ( (Hi - H) /n), где Нi - частная гомозиготность i-го локуса, Н - средняя гомозиготность по n локусам. Часть цифровых материалов обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики с применением персонального компьютера: Microsoft Office Excel. 2003; STATISTICA for Windows. Version 7. 1999.

3.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Характеристика семени быков ОАО «Кабардино-Балкарское»

по воспроизводству и биотехнологиям, по гену каппа-казеина с учетом породы и генеалогического корня. Влияние κ-CNB аллеля на содержание

белка в молоке показаны на многих породах, включая черно-пеструю и даже гибридов зебу х черно-пестрая. Поэтому отбор животных по κ-CNB аллелю интегрирован в селекционные программы молочного скота многих стран мира. В задачу исследований входило проведение оценки генетической структуры по локусу каппа-казеина у 26 племенных быков следующих пород: голштинская черно-пестрой масти, голштинская красно-пестрой

7

масти, бурая швицкая, красная степная, принадлежащих ОАО «Кабардино-Балкарское» по воспроизводству и биотехнологиям (таблица

1).

Как видно из таблицы 1, во всех породах наблюдается преобладание аллеля κ-CNА по каппа-казеину. Частота аллеля κ-CNВ колеблется от 0,0 до 0,3182, наиболее высокий результат наблюдается у красной степной и бурой швицкой пород: соответственно 0,286 и 0,318. Анализируя встречаемость κ- CNВ аллеля можно сказать, что все быки отличаются довольно низкой частотой встречаемости этого аллеля. Полученные материалы свидетельствуют об отборе быковоспроизводящих коров по величине удоя. Установлено, что при увеличении интенсивности отбора наблюдается снижение встречаемости аллельного κ-CNВ варианта. Этот аллельный вариант "вымывается" из генотипа животных, особенно при массовом использовании голштинской породы в качестве улучшающей по удою.

Таблица 1 - Полиморфизм гена каппа-казеина у племенных быков различных пород (n=26)

Примечание: Н – наблюдаемое число генотипов; О – ожидаемое число генотипов; * - нарушено генетическое равновесие

Результаты на особях голштинской породы черно-пестрой масти показывают также, что встречаемость аллеля κ-CNВ имеет незначительный размах изменчивости и находится на уровне низких величин, близких европейским данным - 0,10-0,22 (Strzalkowska N. et al., 2002).

У голштинской красно-пестрой масти κ-CNВ аллель вовсе отсутствовал. Нарушение генетического равновесия по каппа-казеину отмечали только у быков красной степной породы за счет дефицита гетерозиготных и гомозиготных генотипов (χ2 = 5,1; df = 1; P<0,05).

Исследованные быки не обладали κ-CNЕ аллелем, снижающим технологические свойства молока (Lunden A., Afforselles J., 2000).

8

Проведены сравнительные исследования по встречаемости генотипов аллельных вариантов каппа-казеина (κ-CNА и κ-CNВ) у быков различных пород крупного рогатого скота (таблица 2).

Таблица 2 - Сравнительная характеристика локуса каппа-казеина у племенных быков различных пород и регионов Российской Федерации

2- ОАО " Тамбовплем "; 3 - ОАО «ГЦВ СЖ »; 4 - ОАО " Кировплем";

*- нарушение генетического равновесия ( 2 = 5,1; df=1; P<0,05)

Что касается голштинской красно-пестрой масти, то полученные данные имели следующие показатели: κ-CNВ = 0,130-1,0; κ-CNВВ – 0,0-6%. Это характерные данные для пород, специализированных в молочном направлении продуктивности. Что касается красной степной породы этот аллельный вариант встречался с частотой в пределах CNB=0,125-0,360, а частота κ-CNВВ гомозигот составляла от 0 до 14,3%. По встречаемости κ-CNВ