новая папка 1 / 286543
.pdfМИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия» Факультет ветеринарной медицины
Кафедра внутренних незаразных болезней, фармакологии и акушерства им. профессора Г.П. Сердцева
ЭКСПРЕССМЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАЛЛОВ И МЫШЬЯКА В
БИОМАТЕРИАЛЕ, КОРМАХ И ВОДЕ
(Методические указания)
Якутск, 2013
1
УДК 543.544 ББК 244
Д 76
Составители:
К.А. Большакова, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры внутренних незаразных болезней, фармакологии и акушерства им. профессора Г.П. Сердцева факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия»
Н.В. Кузьмина, соискатель кафедры внутренних незаразных болезней, фармакологии и акушерства им. профессора Г.П. Сердцева факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия»
А.Н. Нюкканов, доктор биологических наук, профессор кафедры внутренних незаразных болезней, фармакологии и акушерства им. профессора Г.П. Сердцева факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия»
Цель методических указаний – изучить основные методы извлечения ядов - экстракция жидкостями, изоляция минерализацией и отгонкой с водяным парам.
Экспресс – метод позволяет, обнаружить в минерализате мышьяка, ртути, меди, свинца и бария, которые являются причиной отравления сельскохозяйственных животных, птиц и пресноводной рыбы.
Методические указания позволят ознакомить студентов по специальности 111801 «Ветеринария» с правилами отбора проб, подготовки и проведение исследования.
Рецензенты – Тарабукина Н.П., доктор ветеринарных наук, профессор, заведующая лабораторией микробных препаратов ГНУ «Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» РАСН.
Андреева М.В., кандидат ветеринарных наук, доцент, заведующая кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы, патанатомии и гигиены факультета ветеринарной медицины.
Методические указания рассмотрены и одобрены на заседании методической комиссии факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия» от «___»____________2013 г протокол №____
2
ВВЕДЕНИЕ
Для качественного определения металлов в методических указаниях использованы экспресс - методы, разработанные А.И. Вяхиревым и Ф.Н. Кулаевым, в модификации под руководством А.В. Николаева (ВИЭВ) 1968.
За основу экспресс определения ртути выбран калориметрический дробный метод по А.Н. Крыловой. Дробный метод А.Н. Крыловой был модифицирован и частично изменен сотрудниками лаборатории кафедры физиологии сельскохозяйственных животных, фармакологии и токсикологии (Жуленко В.Н., Георгиева Г.Н., Смирнова Л.А., Большакова К.А. (МТИММП) 1978).
I. Подготовка проб для исследования на определение металлов
Для более быстрого установления причины отравлений сельскохозяйственных животных цинк, медь, барий, свинец и ртути разработаны специальные экспресс - методы обнаружения этих веществ в органах и тканях животных (биоматериале), кормах и воде.
Качественное обнаружение металлов осуществляется с помощью метода осадочной хроматографии на бумаге. Цинк обнаруживают по реакции с дитизоном, медь - с помощью рубеановодородной кислоты, барий и свинец - родизонатом натрия (родизоновокислым натрием), ртуть - капельным методом на фильтровальной бумаге с помощью реакции с меди иодидом (иодистой медью).
Экспресс-методика выгодно отличается от других методов тем, что искомый катион легко определяется в смеси с другими веществами, т. е. без выделения его в чистом виде.
При этом искомый катион определяется даже в том случае, если количество других катионов превышает определяемый в сотни раз.
Перед проведением качественного и количественного определения металлов исследуемый материал (ткани, корма и др.) необходимо разрушить (провести минерализацию) для высвобождения искомых катионов. Это необходимо, так как соединения так называемых тяжелых металлов находятся обычно в более или менее прочном взаимодействии с белковыми веществами в виде альбуминатов или с их компонентами и не могут быть обнаружены ионными реакциями.
Разрушение тканей или кормов (минерализацию) можно проводить обычным сжиганием (сухое озоление) или окислением различными веществами в присутствии кислот (мокрое озоление, мокрая минерализация). Для определения цинка, меди и ртути обычно проводят экспрессную (быструю, но не полную) минерализацию исследуемого материала концентрированной серной кислотой и 30%-ным раствором перекиси водорода
3
(пергидролем). Для обнаружения бария и свинца проводят разрушение тканей концентрированной хлористоводородной (соляной) кислотой и калия хлоратом
(бертолетовой солью), поскольку при взаимодействии с серной кислотой образуются сульфаты бария и свинца, выпадающие в осадок. В этом случае для разрушения 20—30 г
исследуемого материала достаточно 30—50 мин.
Минерализация серной кислотой и концентрированным раствором перекиси,
водорода (пергидролем). Исследуемый материал (кусочки органов и тканей, содержимое желудка, зоба, кишечник со стенками, рвотные массы, корма и др.) при необходимости освобождают от спирта и воды путем нагревания в фарфоровой чашке на кипящей водяной бане. Затем тщательно измельчают материал в чашке Петри с помощью ножниц
(свободных от искомых веществ), берут среднюю пробу 25-30 г материала, помещают в колбу Кьельдаля на 250-500 мл (рис. 1).
Рис. 1
4
После этого в колбу добавляют 12-25 мл 30%-го раствора перекиси водорода (пергидроля), хорошо перемешивают в течение 1-2 мин и очень осторожно, при постоянном помешивании, добавляют 10-20 мл концентрированной серной кислоты (отверстие колбы должно быть направлено от себя). В это время содержимое колбы сильно разогревается и может наступить бурная реакция. После её прекращения колбу осторожно нагревают на закрытом источнике огня (электроплитке), периодически прибавляя пипеткой по 1-2 мл пергидроля до тех пор, пока жидкость не сделается прозрачной, она имеет несколько желтоватый цвет.
Полученную жидкость немного охлаждают, разбавляют таким же объемом воды и нагревают до 110-130°С. В нагретую жидкость для связывания перекиси водорода прибав ляют по каплям 40%-ный раствор формальдегида (формалина). Остатки непрореагировавшего формальдегида удаляют путем нагревания в течение 5-10 мин.
Полноту удаления перекиси водорода проверяют нанесением на фильтровальную бумагу сначала капли 5%-го раствора калия иодида (йоди стого калия), а затем каплю минерализата: при неполно м удалении перекиси водорода пятно окрашивается в буро-
коричневый цвет от выделяющегося йода, при полном удалении препарата окраска не меняется. В случае необходимости в нагретый минерализат добавляют еще несколько капель 40%- го раствора формальдегида.
Минерализация хлористоводородной (соляной) кислотой и калия хлоратом
(бертолетовой солью). Как и в предыдущем случае, 20-25 г тщательно измельченного исследуемого материала помещают в колбу Кьельдаля, заливают концентрированной хлористоводородной (соляной) кислотой, нагревают на электроплитке и прибавляют не большими порциями (на кончике скальпеля) калия хлората до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. Разрушение ткани и других проб, как и в первом случае, происходит в течение 30-50 мин.
Минерализация для определения мышьяка может осуществляться мокрым
(кислотным) и сухим озолением. При сухом озолении к 25 г измельченной средней пробы прибавляют 2,5 г магния нитрата и столько же магния окиси, высуши вают в сушильном шкафу при 120°С и озоляют в муфельной печи, постепенно повышая температуру до 500°С.
При кислотной минерализации навеску помещают в колбу Кьельдаля объемом 250 мл, куда добавляют 10 мл дистилли рованной воды, 10 мл концентрированной азотной, 10 мл серной и 5 мл хлорной кислот. После прекращения вспенивания раствор нагревают до потемнения жидкости, затем, при постоянном нагревании, периодически пипеткой добавляют разбавленную 1:1 азотную кислоту (не допуская обугливания
5
содержимого колбы), пока минерализат не станет бесцветным или соломенно-желтым. Дальнейшее нагревание проводят без добавления азотной кислоты до появления белых паров. Нагрев продолжают еще 5—10 мин.
Денитрация минерализата проводится путем нагревания минерализата с несколькими каплями 40%-го раствора формальдегида; предварительно проверяют минерализат на наличие окислов азота раствором дифениламина в серной кислоте. Разрушение тканей при этом происходит за 45-90 мин в зависимости от содержания в них жиров и клетчатки.
II. Обнаруже ние ме таллов в биомате риале и кормах
Определение цинка
Перед началом исследования небольшое количество мине рализата (1- 2 мл) необходимо разбавить дистиллированной водой в отношении 1 :1 . Затем 2- 3 капли разбавленного ми нерализата на часовом или предметном стекле (свободном от исследуемых веществ) нейтрализуют 25%- ным раствором аммиака (нашатырным спиртом). Для определения нейтраль ной реакции используют лакмусовую бумажку
(индикаторную универсальную бумагу, имеющую специальную шкалу).
Каплю разбавленного и нейтрального минерализата н аносят на полоску обычной фильтровальной или хроматографи ческой бумаги, заблаговременно пропитанной 4%- ным раствором тиомочевины. После этого проводят дополнительную нейтрализацию, удерживая в течение одной минуты полоску бумажки с ранее нанесенной капл ей над горлом небольшой банки (склянки) с 25% - ным раствором аммиака. В после дующем полоску бумажки просушивают на воздухе и под тягой опрыскивают из пульверизатора раствором дитизона в бензоле. При этом в момент опрыскивания при наличии в исследуемой про бе цинка пятно минерализата, нанесенное на полоску фильтровальной бумаги, окрашивается в яркий розоватокрасный или красно малиновый цвет. Спустя несколько минут пятно высыхает и немного утрачивает яркость, однако его розовато - малиновый цвет достаточно хорошо сохраняется в течение неограничен ного времени.
Для того, чтобы убедиться, что реактивы не содержат цинк, необходимо параллельно провести контрольный опыт. Вместо минерализата на фильт -
ровальную бумажку, пропитанную тиомочевиной, наносят дистиллиров анную воду и проделывают те же операции, что и при исследовании минерализата в первом случае. При отсутствии ц и нка в реактивах и воде цвет пятна на фильтро вальной
6
бумажке после опрыскивания раствором дитизона не изменяется.
Не определяются в минерализате и те небольшие количества цинка, которые присутствуют в органах и тканях как микроэлементы.
Приготовление реактивов
Раствор дитизона в бензоле готовится путем растворения 5 мг (0 ,005 г)
дитизона в 10 мл бензола, он имеет темно - зеленый цвет. Готовить его следует в пульверизаторе или в бюксе, из которого (перед опрыскиванием) раствор переливают в пульверизатор. Раствор можно применять в течение не скольких дней, однако лучше его использовать в первые 1 - 3 дня после приготовления.
Фильтровальную бумагу или бумагу для хроматографии нарезают полосками шириной около 4- 5 см и 30 см по дли не. Затем полоски бумаги в небольшой кювете (тщательно вымытой дистиллированной водой) пропитывают в течение 5 - 10 мин
(лучше свежеприготовленным) 4%- ным раствором тиомочевины и высушивают на открытом воздухе (можно по лоски бумаги на вытянутом бинте оставить в лаборатории с вечера до утра). Хорошо высушенные полоски фильтроваль ной или хроматографической бумаги разрезают на небольшие кусочки (около 10 см), х ранят в течение 3- 6 месяцев в плотно закрытой банке и используют по мере необходимости.
Определение меди
2- 3 капли минерализата нейтрализуют на предметном (часовом) стекле 25% - ным раствором аммиака, контролируя процесс лакмусовой бумажкой. Затем каплю нейтрального минерализата наносят на небольшой кусочек фильтровальной
(хроматографической) бумажки, предварительно пропитан ной 4%- ным раствором натрия силиката (кремнекислого нат рия). Дополнительную нейтрализацию пятна на бумажке проводят над горлом небол ьшой банки с концентрированным раствором аммиака (нашатырного спирта). После высушива ния бумажки на воздухе или на закрытом тепловом источни ке место, куда была нанесена капля минерализата, опрыскивают из пульверизатора раствором рубеановодородной кис - лоты.
При наличии в исследуемой пробе (минерализате) мед и пятно окрашивается в темнозеленый (неяркий) цвет.
В том случае, когда пятно окрашивается не четко (сомни тельная реакция),
7
необходимо повысить концентрацию иссле дуемого элемента в минерализате. С этой целью 3- 5- 10 мл минерализата выпаривают в фарфоровой чашке или тигле на закрытом источнике огня (электроплитке). При этом следует добавлять несколько капель концентрированного (30%- го) раствора перекиси водорода (пергидроля) для обесцвечивания темнеющего при нагревании минерализата. Выпарив первоначальный объем минерализата до 3- 5 капель, одну кап лю его наносят на полоску фильтровальной бумаги, далее проделывают все так же, как было указано раньше.
Увеличить концентрацию искомого вещества на полоске фильтровальной бумаги можно и другим способом. Для чего на одно и то же место наносят несколько капель минерали зата, при этом каждая последующая капля наносится только после полного высыхания предыдущей и не должна превы шать размеры первого пятна.
Контрольное исследование проводят с дистиллированной водой так, как и при определении меди. Медь, содержащаяся в тканях организма как микроэлемент,
этим методом не определяется.
Приготовление реактивов
Раствор рубеановодородной кислоты получают растворе нием 100 мг (0,1 г)
рубеановодородной кислоты в 10 мл 95% - го спирта этилового (ректификата). Раствор хранится при обычных комнатных условиях, пригоден для проведения исследований в течение недели.
Фильтровальную бумагу, пропитанную селикатом натрия (кремнекислого натрия), получают путем пропитывания поло сок фильтровальной или хроматографической бумаги (4 - 5×30см) свежим 4%- ным раствором селиката натрия. Пропи тывание проводится в небольшой кювете в течение несколь ких минут, после чего полоски бумаги тщательно просуши вают при комнатной температуре, нарезают на небольшие кусочки (4- 5×10 см) и хранят в плотно закрытых банках (емкостью около 500 г) в течение 6- 12 месяцев.
Определение бария
Как и в ходе предыдущих исследований 3- 5 капель минерализата на часовом стекле или на кусочке стекла (обезжи ренных и тщательно промытых дистиллированной водой) ней трализуют 25%- ным раствором аммиака
8
(концентрированным нашатырным спиртом). Каплю нейтрализованного мине - рализата наносят на кусочек фильтровальной бума жки, предварительно пропитанной 4%- ным раствором натрия тартрата (виннокислого натрия).
После высушивания пятна на полоске фильтровальной бумаги на воздухе или подсушивания на закрытом источнике тепла место нанесения его опрыскивают из пульверизатора сначала свежеприготовленным раствором родизоната (роди - зоновокислого) натрия, а затем буферным раствором с рН - 2,8.
При наличии в исследуемом материале бари я пятно на бумажке окрашивается в оранжевокрасноватый цвет.
Контрольный опыт с дистиллированной водой можно проводить на той же полоске пропитанной фильтровальной бумажки, на которую наносили исследуемый минерализат, нанося каплю воды на расстоянии 3 - 4 см от капли минерализата.
Иногда на полоске фильтровальной бумажки после обра ботки ее раствором родизоната натрия отмечается нечетко выраженное оранжево - красное окрашивание, тогда проводят дифференцировочное исследование, исключая наличие свинца.
Для этой цели на небольшую часть оранжево - красного пятна наносят с помощью глазной пипетки небольшую каплю 1 0%- го раствора натрия сульфата (сернокислого натрия). Если оранжево - красная окраска тотчас же исчезает, то это указывает на присутствие в исследуемой пробе бария. В том случае, когда окраска части пятна после нане сения раствора натрия сульфата не меняется , делают заключение о присутствии в исследуемой пробе свинц а.
Приготовление реактивов
Раствор родизоната (родизоновокислого) натрия готовится растворением 50 мг
(0,05 г) в 10 мл дистиллированной воды. Раствор вначале слегка желтоватого цвета, затем бы стро темнеет в связи с разложением реактива, поэтому в ходе исследований надо использовать только свежеприготовленный раствор . В связи с этим необязательно готовить 10 мл раство ра, достаточно для обработки 5 - 10 кусочков пропитанной фильтровальной бумаги сд елать 5 мл раствора, отвесив только 25 мг (0,025 г) родизоната натрия и использовать его в течение нескольких часов.
Фильтровальную (хроматографическую) бумагу (ее полоски 4- 5Х30 см) для анализа готовят пропитыванием в кювете свежеприготовленным 4% - ным раствором
9
натрия тартрата (виннокислого натрия), после чего хорошо высуши вают на воздухе, на вытянутом бинте в любом месте лаборато рии или в вытяжном шкафу.
Хранятся нарезанные полоски пропитанной фильтровальной бумаги (4 - 5Х10 см) в стеклянной банке с притертой пробкой и пригодны для исследо вания в течение 1
года.
Буф е рный раствор с pH 2,8 получают из двух растворов.
Раствор «А» готовят растворением 3,563 г натрия гид рофосфата (натрия фосфорнокислого двузамещенного - NaHP04 ∙ 12Н2 0) в дистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл.
Р а с т в о р «Б» получают растворением 2,101 г лимонной кислоты в дистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл.
Буферный раствор с pH 2,8 получают смешением 1,58 мл раствора «А» с 8,42
мл раствора «Б». Готовый раствор мож но использовать для исследования проб (минерализата) на наличие бария или свинца в течение 1 месяца.
Определение свинца
Перед началом исследования минерализат хорошо подо гревают (не доводят до кипения), для того чтобы свинца хлорид (хлористый свинец) перевести в растворенное состояние, поскольку при охлаждении минерализата он выпадает в осадок.
Каплю горячего минерализата наносят на кусочек фильт ровальной бумаги,
пропитанной 4%- ным раствором тартрата натрия (виннокислого натрия), и держат над горлом банки с 25%- ным раствором аммиака (концентрированного нашатырного спирта) до полной нейтрализации хлористоводородной кислоты
(соляной кислоты).
После этого бумажку с нанесенным минерализатом просушивают на воздухе или закрытом источнике тепла и опр ыски вают из пульверизатора раствором родизоната натрия, а затем буферным раствором с pH 2,8. При наличии свин ца в исследуемом материале пятно на фильтровальной бумажке в момент опрыскивания окрашивается в светлофиолетовый (сиреневый) цвет. Если в исследуемом материале содержится незначительное количество свинца, то пятно приобретает красноватооранжевый цвет.
Для дифференцирования на часть окрашенного пятна, как это показано на (рис. 2) наносят маленькую каплю 10%- го раствора сульфата натрия (сернокислого натрия).
10