Labor_practicum_microb

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, бактериологические петли, спиртовка, стерильные чашки Петри с МПА и средой Эндо, исследуемые пробы воды, столик для окрашивания препаратов, промывалка с водой, красители для окраски по Граму, установка вакуумной фильтрации «Владисарт», мембранные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм, системы индикаторные бумажные (СИБ), для идентификации энтеробактерий, производства Нижегородского предприятия бактерийных препаратов, стерильный физиологический раствор; термостат с температурой 37 °С.

Ход выполнения работы

1.Отберите пробы воды в стерильные флаконы или колбы в объеме 50 или 100 мл непосредственно перед началом занятия: а) пробу водопро водной воды; б) пробу из отрытого водоема (ручей, ключ, пруд). До начала занятия (посева) пробы можно хранить не более 3 ч при температуре не выше 4 °С.

2.Приготовьте ряд последующих 10-кратных разведений отобран ных проб в пробирках, в зависимости от предполагаемой численности микроорганизмов в пробе. Для приготовления каждого последующего раз ведения используйте новую пипетку.

3.Полученные разведения в объеме 0,1 мл посейте (на каждое раз ведение по 2 - 3 чашки):

а) на МПА для определения общего числа бактерий; б) на среду Эндо для учета БГКП (бактерии группы кишечной па

лочки или энтеробактерии).

4.В чашки Петри с МПА и средой Эндо внесите по 0,1 мл послед него и предпоследнего разведений, равномерно распределите каплю инокулята на поверхности агара, покачивая чашку, и оставьте на 30 мин для адсорбции при комнатной температуре.

5.Засеянные чашки Петри через 30 мин переверните вверх дном и поместите в термостат при температуре 28 - 37 °С для выращивания мезофильной микрофлоры. Количество бактерий учитывайте через 1 -2 сут.

6.Водопроводную воду исследуйте также методом мембранных фильтров, которые простерилизуйте кипячением в течение 30 мин. Фильт ровальную установку «Владисарт» подготовьте к работе вместе с препода вателем.

61

7.Профильтруйте пробу водопроводной воды в объеме 100 мл. Сте рильным пинцетом фильтр аккуратно перенесите в чашку Петри с МПА (для определения общего числа бактерий) и средой Эндо и поместите в термостат с температурой 37 °С.

8.Учитывайте количество колоний следующим образом: дно чашки Петри маркером разделите на равные секторы, учтенные колонии отмечай те точками на стекле. Для определения титра подсчитайте среднее число колоний на чашке и умножьте на разведение.

9.Для подтверждения принадлежности к БГКП из колоний, вырос ших на среде Эндо, приготовьте фиксированные мазки, окрасьте их по Граму, промикроскопируйте. Грамотрицательные бактерии протестируйте по биохимическим свойствам с системой индикаторной бумажной (СИБ) для идентификации энтеробактерий.

10.Подсчитайте количество колоний кишечной палочки на 1 мл воды по формуле (см. с. 47).

11.Результаты запишите в табл. 11.

Таблица 11

Количественный учет бактерий в пробах воды

Лабораторная работа № 26 Определение

бактериальной обсемененности воздуха

Цель работы. Освоить определение бактериальной обсемененности воздуха методами оседания и фильтрования.

62

Материалы и оборудование. Стерильные чашки Петри с МПА, установка вакуумной фильтрации «Владисарт», мембранные фильтры с диаметром пор 0.2 мкм; термостат с температурой 37 0С.

Ход выполнения работы

1.Чашки Петри с МПА поставьте в различных помещениях, указан ных преподавателем, откройте крышки и экспонируйте 5 - 1 5 мин, в зави симости от предполагаемого бактериального загрязнения.

2.Через указанное время чашку закройте и инкубируйте в термоста те с температурой 37 0С в течение суток.

3.Подсчитайте среднее количество колоний, выросшее на чашке и рассчитайте среднее микробное число по формуле

B

где Х- количество микробов в 1 м3 воздуха; - 10-t в А - количество колоний в чашке;

В — площадь чашки Петри (при диаметре 8 см - 50 см2 , 9 см - 63 см ); t - время экспозиции в опыте, мин; 5 - время экспозиции, мин; 10 - объем воздуха, из которого происходит оседание микробов за

5 мин, л; 100 - площадь, на которую происходит оседание, см2; 1

000 - объем воздуха, л.

4.Соберите фильтрационную установку «Владисарт», пропускайте через неѐ воздух в течение 5 мин, затем стерильным пинцетом аккуратно перенесите фильтр на чашку Петри со стерильным МПА.

5.Инкубируйте чашку с фильтром в течение суток при температуре 37 °С и подсчитайте количество колоний, выросших на фильтре в соответ ствии с инструкцией к прибору.

6.Полученные результаты запишите в табл. 12.

Таблица 12

Определение бактериальной обменности воздуха

63

VII. УЧАСТИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ В КРУГОВОРОТЕ ВЕЩЕСТВ В ПРИРОДЕ

Микроорганизмы активно участвуют в процессах разложения органических азотсодержащих веществ, в превращении углеводов в органические кислоты и другие продукты, в восстановлении неорганических соединений серы до сероводорода и окисления соединений железа, способствуя круговороту веществ.

Лабораторная работа № 27 Получение

накопительной культуры денитрифицирующих бактерий

Цель работы. Освоить метод получения накопительной культуры денитрифицирующих бактерий, методы определения нитратов, нитритов и аммиака в среде культивирования.

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, почва, бактериологические петли, спиртовка, пинцет, скальпель, компоненты для среды Гильтая или готовая среда в пробирках, парафиновое или вазелиновое масло, красная лакмусовая бумага, 1%-ный водный раствор фуксина или генцианвиолета, дифениламин, 20%-ный раствор серной кислоты, 10%-ный раствор хлорида бария, цинк-йод-крахмал, реактив Несслера.

Ход выполнения работы

1.Приготовьте среду Гильтая следующего состава, г/л: лимонно кислый калий или натрий (трехзамещенный) - 5,0; KNO3 - 2,0, KH2PO4 -

2,0; MgSO4 - 2,0; CaCO3 - 0,2; аспарагин - 1,0; FeCl3 - следы; вода водо проводная. рН среды доведите до 6,8 - 7,2 10%-ными растворами NaOH и HCl. Среду разлейте в пробирки высоким слоем и стерилизуйте в автокла ве при 0,5 атм 20 мин.

2.Поместите в пробирки со средой комочек почвы, на поверхность среды аккуратно по стенке пробирки налейте 0,2 мл вазелинового масла для создания анаэробных условий и инкубируйте в термостате при 30 -37 °С в течение 1 - 2 недель. Одну пробирку оставьте незасеянной в качестве кон троля.

64

3.Через 7 - 1 4 сут просмотрите посевы, отметьте помутнение сре ды, выделение газов, изменение цвета (сине-зеленый цвет является следст вием размножения бактерий Pseudomonas aeruginosa).

4.Проведите тесты на наличие аммиака и отсутствие нитратов и нитритов. Аммиак обнаруживают по запаху и посинению красной лакму совой бумаги или с помощью реактива Несслера. Нитраты и нитриты об наруживают по реакции с реактивом цинк-йод-крахмал: к трем каплям цинк-йод-крахмала добавляют одну каплю 20%-ного раствора серной ки слоты и одну каплю исследуемой среды. Синий цвет свидетельствует о на личии азотистой кислоты.

5.Приготовьте фиксированные мазки полученных культур, по красьте и микроскопируйте. Зарисуйте морфологию клеток денитрифици рующих бактерий.

Лабораторная работа № 28

Накопительные культуры микроорганизмов, разрушающих целлюлозу

Цель работы. Освоить метод получения накопительной культуры микроорганизмов, разрушающих целлюлозу.

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, стерильная фильтровальная бумага, стерильные стеклянные палочки, бактериологические петли, спиртовка, пинцет, скальпель, стерильные чашки Петри, компоненты для среды Гетчинсона или готовая среда, почва.

Ход выполнения работы

1.Приготовьте среду Гетчинсона следующего состава, г/л: KH2PO4 -

0,1; NaCl - 0,1; CaCl2 - 0,1; TeCl3 - 0,1; MgSO4 .7Н2О - 0,3; NaNO3 - 2,5;

агар-агар - 20 г (2 %).

2.Среду разлейте в чашки Петри и на поверхность положите стериль ную фильтровальную бумагу, вырезанную по размеру диаметра чашки.

3.Комочки почвы разложите на поверхность фильтра стерильной стек лянной палочкой параллельными рядами на расстоянии 1 см друг от друга.

4.Поместите чашки в термостат при 30-37 0Си инкубируйте в те чение 10-14 сут.

5.После инкубации просмотрите посевы, определите образование колоний целлюлозоразлагающих бактерий, вокруг них бумага становится прозрачной, ослизняется, видны желтые, зеленые, оранжевые и коричне-

65

вые пятна. Подсчитайте процент колоний целлюлозоразлагающих бактерий в вашей пробе почвы (общее количество комочков почвы - 100 %, целлюзообразующих бактерий - х %).

6. Приготовьте препарат «раздавленная капля» из зон разрушения клетчатки. Опишите и зарисуйте морфологию клеток целлюлозоразлагающих бактерий.

Лабораторная работа № 29 Накопительная

культура сульфатредуцирующих бактерий

Цель работы. Освоить метод получения накопительной культуры сульфатредуцирующих бактерий.

Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, бактериологические петли, спиртовка, столик для окрашивания препаратов, промывалка с водой, красители для окраски по Граму, стерильные пробирки, компоненты для среды Постгейта или готовая среда, резиновые пробки, парафин, пробы сточной воды или почвы (лучше болотной).

Ход выполнения работы

1.Приготовьте среду Постгейта следующего состава:

-раствор 1, г: KH2PO4 - 1,0; NH4Cl - 1,0; СаС12-Н2О; MgSO4 -7H2O - 2,0; лактат Na (70%-ный раствор) - 3.5; дрожжевой экстракт - 1,0; рН =

=7,4; дистиллированная вода - 980 мл;

-раствор 2, г: FeSO4 -7Н2О - 0,5; дистиллированная вода - 10 мл;

-раствор 3, г: аскорбиновая кислота - 0,1; Na-тиогликолят - 0,1; дистиллированная вода - 10 мл, рН = 7,4.

Растворы простерилизуйте отдельно, затем слейте и расфасуйте по стерильным пробиркам до самого верха.

2.Внесите почву или пробу сточной воды, плотно закройте пробир ки резиновыми пробками и залейте парафином.

3.Инкубируйте пробирки в течение 20 - 25 сут в термостате при 30 -37°С.

4.Просмотрите посевы после инкубации. Пробы считают положи тельными по сульфатредуцирующим бактериям, если в пробирках осадок после инкубации почернел.

5.Приготовьте фиксированный мазок, окрасьте, посмотрите под иммерсионным объективом.

6.Опишите характер роста в пробирках и зарисуйте морфологию клеток сульфатредуцирующих бактерий.

66

ПРОВЕРОЧНЫЕ ТЕСТЫ

1. Какую популяцию микроорганизмов называют чистой?

а) состоящую из микроорганизмов одинаковой морфологии; б) состоящую из микроорганизмов одного вида;

в) состоящую из микроорганизмов с одинаковыми биохимически ми свойствами; г) состоящую из микроорганизмов с одинаковыми культуральными свойствами.

2.Какую популяцию микроорганизмов называют смешанной? а) состоящую из микроорганизмов разной морфологии;

б) состоящую из микроорганизмов с разными биохимическими свойствами; в) состоящую из микроорганизмов разных видов;

г) состоящую из микроорганизмов по-разному окрашивающихся по Граму.

3.Что такое инокуляция микроорганизмов?

а) внесение микроорганизмов в нестерильную среду; б) внесение микроорганизмов в жидкую питательную среду; в) внесение микроорганизмов в стерильную среду;

г) внесение микроорганизмов в плотную питательную среду.

4.Что такое стерилизация? а) очищение; б) обеспложивание;

в) обеззараживание; г) дезинфекция.

5.Что означает термин «дезинфекция»? а) очищение; б) обеспложивание;

в) обеззараживание; г) стерилизация.

67

6. Автоклавирование - это:

а) стерилизация кипячением; б) стерилизация паром;

в) стерилизация насыщенным паром под давлением; г) стерилизация газообразными средствами.

7. Тиндализация - это:

а) стерилизация кипячением; б) дробная стерилизация текучим паром;

в) стерилизация насыщенным паром под давлением; г) стерилизация газообразными средствами.

8.Питательные среды, содержащие в своем составе углеводы стерилизуют: а) кипячением; б) тиндализацией;

в) автоклавированием; г) пастеризацией.

9.Пастеризация-это:

а) стерилизация кипячением; б) дробная стерилизация текучим паром;

в) стерилизация насыщенным паром под давлением; г) однократный прогрев при температуре ниже 100 0С.

10. Стерилизацию фильтрованием применяют:

а) для питательных сред, которые содержат жиры; б) питательных сред, которые содержат легко разрушающиеся компоненты; в) питательных сред, которые содержат белки;

г) питательных сред, которые содержат неорганические соединения.

11. Все бактериальные клетки имеют основные структуры и дополни тельные. Какая из перечисленных ниже структур является основной?

а) капсула; б) жгутики;

в) цитоплазма; г) пили.

68

12.Все бактерии делятся на две группы по способности окрашиваться по Граму: грамположительные и грамотрицательные. В какой цвет окраши ваются грамотрицательные бактерии?

а) розово-красный; б) зеленый; в) сине-фиолетовый;

г) коричнево-желтый.

13.В составе клеточной стенки содержится определенное количество по лисахаридов, липидов, белков и пептидогликана, количество которого раз лично у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Какое коли чество пептидогликана содержится в клеточной стенке грамположитель ных бактерий, %?

а) 5-10;

б )10 - 20; в) 40 - 90; г) 10-30.

14.Бациллами называют бактерии, которые: а) не образуют спор; б) образуют споры;

в) образуют споры и размер их не превышает диаметра клетки; г) образуют споры и размер их превышает диаметр клетки.

15.По форме бактерии бывают шаровидные, палочковидные, извитые и ветвящиеся. Бактерии, которые имеют извитую форму, называются:

а) кокками; б) спирохетами;

в) актиномицетами; г) палочками.

16.Жизнедеятельность бактерий, протекающая в присутствии свободного кислорода, называется:

а) брожением; б) окислением; в) аэробиозом;

г) восстановлением.

69

17.Рост периодической культуры бактерий, выращиваемой в жидкой пи тательной среде, подразделяют на несколько фаз или периодов. Период между посевом бактерий и началом размножения называется:

а) фазой экспоненциального, или логарифмического, роста; б) фазой гибели; в) лаг-фазой;

г) фазой стационарного роста.

18.Питательные среды, в состав которых входят лишь соединения опреде ленного химического состава, взятые в точно указанных количествах, на зываются:

а) натуральными; б) дифференциально-диагностическими;

в) полу синтетическими; г) синтетическими.

19.Питательные среды, которые дают возможность быстро отличить одни виды бактерий от других, называются:

а) натуральными; б) дифференциально-диагностическими;

в) полу синтетическими; г) синтетическими.

20.Микроорганизмы участвуют в минерализации органических соедине ний растительного и животного происхождения до неорганических. В кру говороте углерода принимают участие:

а) сальмонеллы; б) цианобактерии;

в) кишечные палочки; г) актиномицеты.

21. В естественных условиях бактерии развиваются при определенных диапазонах температур. Бактерии называют мезофилами, если они растут при температуре, °С:

а) от 10 до 47;

б) от 40 и выше;

в) от 37 до 45; г) от -50 до 10.

70