Отчет БиоТех

Выделение нуклеиновых кислот. Экстракция РНК фенол-хлороформным методом. Экстракция ДНК на спин-колонках.

В данной лабораторной работе целью являлось выделение РНК и ДНК актина из коммерческих образцов «ExtractRNA» по фирменному протоколу. Актин – глобулярный белок, из которого образованы микрофиламенты. РНК из клеток выделялся фенол-хлороформной экстракцией, а ДНК – методом на спин-колонках.

1. Экстракция РНК фенол-хлороформным методом.

Метод фенол-хлороформной экстракции основан на образовании двухфазной эмульсии после центрифугирования смеси (фенол + хлороформ + клеточный лизат). Верхняя фаза – водная, в ней находится РНК; нижняя фаза – гидрофобная, в которой находятся углеводы, липиды и другие части клеток. Непрозрачный слой между фазами состоит из белков.

Используемые материалы:

• Культура клеток

• Лизирующий раствор ExtractRNA (1 мл)

• Хлороформ (200 мкл)

• Изопропанол (500 мкл)

• 75% этанол (1 мл)

• Nuclease-free water (20 мкл)

Ход работы:

I. Этап гомогенизации

1. Центрифугируем суспензию клеток 5 мин на оборотах 200g.

2. Сольем супернатант из культурального пробиркии, добавим 1 мл лизирующего раствора ExtractRNA.

3. Оставляем инкубироваться 15 минут при комнатной температуре для полной диссоциации нуклеопротеидных комплексов.

4. Центрифугируем пробирку на оборотах 12-15 тыс. g 10 минут.

5. Необходимо удалить нерастворенные фрагмены.

6. Супернатант перелить в новую пробирку.

II. Этап разделения фаз.

7. Добавляем 200 мкл хлороформа в пробирку.

8. Перемешиваем, потряхивая в руке пробирку в течении 15 секунд и инкубируем при комнатной температуре 5 минут.

9. Полученный образец центрифугируем 15 минут (при 4^оС и 12000 оборотов) Получаем разделение образца на фазы. Нижняя желтая фенол-хлороформную фаза, бесцветная верхняя, водная с искомой взвесью РНК и промежуточным слоем из белков.

10. Аккуратно наклоняем пробирку под углом (45 градусов), отбераем верхнюю прозрачную фазу в новую пробирку, во избежание загрязнения образца.

III. Этап экстракции РНК.

11. Добавим 500 мкл изопропанола в пробирку.

12. Инкубируем пробирку в течении 10 минут при комнатной температуре

13. Центрифугируем 10 минут на 12000g

14. Удалим микропипеткой надосадочную жидкость, оставив на дне пробирки жидкость с преципитированной РНК.

15. Добавим 1 мл 75 % этанола в пробирку с преципитированной РНК.

16. Центрифугируем 10 минут при оборотах 12000g.

17. Убираем надосадочную жидкость, оставив остаток РНК на дне пробирки.

18. Высушиваем РНК в течение 10 минут на воздухе.

19. Разводим высушенную РНК в 20 мкл Nuclease-free water (вода без нуклеаз).

20. Измерим концентрацию полученной РНК и производим оценку качества на спектрофотометре. Были получены следующие результаты.

Полученные результаты:

Измерения	Концентрация РНК (нг/мкл)	А260/280	А260/230
I измерение	223	1,88	1,7
II измерение	210	1,91	1,62
III измерение	228	1,89	1,64
Среднее значение	220,3	1,89	1,65

Вывод: концентрация полученной в результате экстракции РНК достаточна для следующих экспериментов, белковое загрязнение отсутствует (А260/280 >1,8), значительное загрязнение органическими соединениями (фенолом) также отсутствует (А260/230 = 1,65 <1,8), тем не менее небольшое загрязнение фенолом есть, что может быть вызвано его использованием в качестве основного реактива для выделения и отсутствием стадий очистки.

2. Экстракция ДНК на спин-колонках.

Метод выделения на спин-колонках заключается в выделении ДНК на силикатных частицах. При повышенной концентрации соли и в щелочной среде ДНК соединяется с силикой, что дает возможность убрать ненужные вещества. Во время центрифугирования ДНК остается на спин-колонке, а все лишнее устраняется.

Используемые материалы:

• Культура клеток

• Лизирующий раствор (100 мкл)

• Протеинкиназа К (10 мкл)

• Суспензия GAUSS (10 мкл)

• 95% этанол

• Связывающий раствор М (400 мкл)

• Промывочный раствор (700 мкл)

• Элюирующий раствор (50 мкл)

Ход работы:

I. Приготовление смеси для лизиса

1. Смешаем 100 мкл лизирующего раствора и 10 мкл протеинкиназы К.

2. Подогреем до 56 С^о и добавим к образцу.

II. Выделение ДНК из клеточного осадка

3. Добавим к смеси 10 мкл суспензии GAUSS, предварительно перемешав её до однородности.

4. Взбалтываем пробирку на VORTEX в течении 20 секунд.

5. Инкубируем смесь в течении 10 минут при 56 С^о.

6. Добавляем 100 мкл 95% этанола и перемешиваем.

7. Добавим 400 мкл связывающего раствора М, перемешиваем.

8. Центрифугируем смесь в течении 1 минуты, при 11000g.

9. Переносим надосадочную жидкость на спин-колонку и центрифугируют в течение минуты.

10. Добавляем 700 мкл промывочного раствора, снова центрифугируем в течение минуты и сливаем осадок.

11. Повторяем 10 пункт 3 раза.

12. Минуту центрифугируем пустую колонку при 11000g.

13. Сушим на воздухе в течение 5 минут.

14. Добавляем 50 мкл элюирующего раствора в центр спин-колонки и инкубируем 1 минуту.

15. Переносим спин-колонку в чистую пробирку и центрифугируем.

16. Измеряем концентрацию полученной ДНК и оцениваем ее качество с помощью спектрофотометра. Были получены следующие результаты.

Полученные результаты:

Измерения	Концентрация РНК (нг/мкл)	А260/280	А260/230
I измерение	180,4	1,89	1,38
II измерение	176,8	1,80	1,2
III измерение	188,4	1,85	1,24
Среднее значение	181,9	1,85	1,27

Вывод: полученная ДНК требует дополнительной очистки, так как коэффициент А260/230 сильно снижен 1,8, что свидетельствует о загрязнении органическими веществами, содержащими бензольное кольцо (например растворами, использованными в процессе выделения ДНК). Полученная концентрация достаточна для проведения дальнейших экспериментов, однако она может быть измерена с большой погрешностью.

Обратная транскрипция РНК. Получение кДНК.

Выделенная 11 апреля 2022 года РНК с концентрацией 220,3 нг/мкл использовалась для получения кДНК с использованием метода обратной транскрипции. Обратная транскрипция — это процесс образования двуцепочечной кДНК на основании информации в РНК-матрице. Данный процесс проводится с использованием специального фермента – обратной транскриптазы (ревертазы) – которая при использовании праймера на основе имеющейся последовательности РНК синтезирует комплементарную цепь ДНК (кДНК), что в дальнейшем позволяет посредством ПЦР произвести увеличение концентрации целевого гена для нужд исследования.

Используемые материалы:

• Полученная 11.04.22 РНК

• Олиго(dT) праймер

• Рандомный праймер,

• Nuclease-free water

• 5X буфер

• dNTP

• DDT

• MMLV ревертаза

Ход работы:

1. В одну пробирку добавляем 2 мкл полученной ранее РНК, 1 мкл рандомного праймера, 1 мкл олиго(dT) праймера и 5 мкл Nuclease-free water.

2. Пипетируя аккуратно перемешиваем полученную смесь, капли сбрасываем на микроцентрифуге.

3. Прогреваем смесь 2 минуты при 70 С^о для расплавления вторичных структур.

4. Полученные образцы помещаем на лед.

5. Готовим вторую смесь в другой пробирке. Добавляем 4 мкл 5Х буфера для синтеза первой цепи, 2 мкл смеси dNTP, 2 мкл DDT, 1 мкл MMLV ревертазы, 2 мкл Nuclease-free water.

6. Добавим полученную смесь к первой и перемешиваем, капли сбрасываем на микроцентрифуге.

7. Инкубируем полученную смесь в течение часа на 37 С^о.

8. Чтобы остановить реакцию обратной транскрипции прогреваем смесь в течение 10 минут при 70 С^о.

Полученный результат: 20 мкл кДНК, содержащего транскрипты всех экспрессированных генов.

Вывод: полученная в ходе данной лабораторной работы кДНК белка актина может быть использована для наработки нужных участков гена с помощью ПЦР для клонирования в вектор.