ДНК-полимераза
Одной из ключевых молекул в репликации ДНК является фермент ДНК-полимераза. ДНК-полимеразы отвечают за синтез ДНК: они присоединяют нуклеотиды один за другим к растущей цепи ДНК, включая в неё только те нуклеотиды, которые комплементарны матрице.
Вот некоторые основные особенности ДНК-полимеразы:
Им всегда нужна матрица
Они могут присоединять нуклеотиды только к 3'-концу цепи ДНК
Они не могут начать синтез новой цепи ДНК с нуля, поэтому им необходимо наличие уже существующей цепи и короткого фрагмента , называемого праймером или затравкой.
Они корректируют, то есть проверяют свою работу, удаляя большинство «неправильных» нуклеотидов, которые по ошибке встраиваются в новую цепь.
Для присоединения нуклеотидов к цепи требуется энергия. Источником этой энергии являются сами нуклеотиды, к которым прикреплены три фосфата (подобно молекуле АТФ, несущей энергию). Когда связь между фосфатами разрушается, высвобождаемая энергия используется для образования связи между присоединяющимся нуклеотидом и растущей цепью.
[Давайте рассмотрим реакцию полимеризации]
У прокариот, таких как E. coli, есть две основные ДНК-полимеразы, участвующие в репликации ДНК: ДНК-полимераза III (основной фермент, участвующий в синтезе ДНК) и ДНК-полимераза I, играющая вспомогательную роль, которую мы рассмотрим позже.
Начало репликации днк
Как
ДНК-полимеразы и другие факторы репликации
узнают, откуда им начать? Репликация
всегда начинается в определенных местах
ДНК, так называемых точках
начала репликации,
которые распознаются по нуклеотидной
последовательности.
E. coli, как и большинство бактерий, имеет единственную точку начала репликации на своей хромосоме. Длина этого фрагмента составляет около 245245245 пар оснований и содержит в основном пары оснований A/T (которые удерживаются вместе меньшим количеством водородных связей, чем пары оснований G/C), что облегчает разделение цепей ДНК.
Специализированные белки распознают этот участок и связываются с ним, разъединяя цепи ДНК. В результате образуются две Y-образные структуры, называемые репликационными вилками, которые вместе образуют так называемый репликационный пузырь. В процессе репликации вилки двигаются в противоположных направлениях.
Бактериальная хромосома. Двухцепочечная ДНК кольцевой хромосомы бактерии раскрывается в точке начала репликации, образуя репликационный пузырь. Каждый конец пузыря представляет собой репликационную вилку, Y-образное соединение, где двухцепочечная ДНК расходится на две одинарные нити. На репликационных вилках синтезируются новыю ДНК, комплементарные каждой отдельной цепи. Две вилки движутся в противоположных направлениях по окружности хромосомы, увеличивая таким образом с двух сторон репликационный пузырь.
Как на самом деле происходит репликация в репликационных вилках?
Геликаза - первый фермент, прикрепляется к точке начала репликации. Задача геликазы - продвигать вилки репликации вперед, «расплетая» ДНК (разрывая водородные связи между азотистыми основаниями).
Специальные белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК, обволакивают отдельные нити ДНК возле репликационной вилки, предотвращая их повторное объединение в двойную спираль.
Праймеры и праймаза
ДНК-полимеразы могут добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей цепи ДНК. Они используют свободную группу -ОН, находящуюся на 3'-конце, в качестве «крючка», прицепляя новый нуклеотид к этой группе в результате реакции полимеризации. Как же тогда ДНК-полимераза присоединяет первый нуклеотид на новой репликационной вилке?
В одиночку она это сделать не может! Эта проблема решается с помощью фермента праймазы. Праймаза создает РНК праймер или короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, комплементарный матрице, который формирует 3'-конец для работы ДНК-полимеразы. Типичный праймер имеет длину от пяти до десяти нуклеотидов. Праймер способствует началу синтеза ДНК, то есть даёт ему старт.
Как только РНК-праймер синтезирован, ДНК-полимераза «удлинняет» его, добавляя нуклеотиды один за другим, чтобы получить новую цепь ДНК, которая комплементарна матричной цепи.
Лидирующая и отстающая цепи
У бактерии E. coli, ДНК-полимераза, которая осуществляет большую часть синтеза, является ДНК-полимеразой III. На репликационной вилке находятся две молекулы ДНК-полимеразы III, каждая из которых усердно работает над одной из двух новых цепей ДНК.
ДНК-полимеразы могут добавлять нуклеотиды только к 3'-концу существующей цепи ДНК. Они используют свободную группу -ОН, находящуюся на 3'-конце, в качестве «крючка», прицепляя новый нуклеотид к этой группе в результате реакции полимеризации. Как же тогда ДНК-полимераза присоединяет первый нуклеотид на новой репликационной вилке?
Одна новая цепь, которая проходит от 5' к 3'-концу по направлению к вилке репликации, является простой. Эта цепь создается непрерывно, потому что ДНК-полимераза движется в том же направлении, что и вилка репликации. Эта непрерывно синтезируемая цепь называется лидирующей цепью.
В другой новой цепи, которая направлена от репликационной вилки от 5'-конца к 3'-концу, всё немного сложнее. Эта цепь строится фрагментами, потому что по мере движения вилки ДНК-полимераза удаляется от неё, и ей в какой-то момент приходится отрываться и снова присоединяться к новому открывшемуся фрагменту. Эта цепь, достраивающаяся фрагментами, называется отстающей цепью.
Маленькие фрагменты называются фрагментами Оказаки. Они названы в честь японского ученого, который их обнаружил. Лидирующая цепь может быть синтезирована на основании одного праймера, в то время как отстающая цепь нуждается в новом праймере для каждого из коротких фрагментов Оказаки.