Учебное пособие 722

меняться пропорционально используемому методу пробоподготовки, в соответствии с качеством получаемого препарата ДНК.

3.7. Проблема контаминации

Потенциально высокая чувствительность полимеразной цепной реакции делает совершенно необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это связано с наиболее острой проблемой метода - контаминацией. Контаминация — попадание из внешней среды в реакционную смесь. специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки.

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является использование фермента N-урацил-гликозилазы (УГ)- В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием смеси дНТФ, в которой дТТФ заменен на дУТФ (ур а- цил), и после термоциклирования все образующиеся в пробирке ампликоны будут содержать урацил. Если до амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь ампликоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.

Другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации.

19

Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идёт со 100% эффективностью и, соответственно, после инактивации продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фрагмента хотя бы несколько останутся целыми, что существенно снижает ценность такого подхода. Кроме того, всегда остается риск кроссконтаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки.

Таким образом, оба эти метода лишь в некоторой степени позволяют устранить источник контаминации и не гарантируют от ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Есть третий способ борьбы с результатами контаминации, рассматриваемый скорее как казусный – значительное уменьшение количества циклов реакции (до 25-30 циклов). Но даже при таком подходе риск получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов велик.

Для уверенности в отсутствии контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать отрицательными контролями. В качестве отрицательного контроля рекомендуется использовать воду из комнаты пробоподготовки (после каждого десятого клинического образца желательно обрабатывать вместо биологического образца пробирку с водой).

Все реактивы рекомендуется хранить разлитыми на отдельные порции (аликвоты).

4. Задание к выполнению лабораторной работы

4.1. Изучить теоретические основы ПЦР 4.2. Провести самостоятельную постановку ПЦР с по-

мощью данного программного пакета. 4.3.Требования к отчету по лабораторной работе

Студент должен изучить теоретическое введение; получить вариант задания; выполнить задание; подготовить и сдать отчет; продемонстрировать этапы постановки преподавателю; ответить на контрольные вопросы.

20

5. Контрольные вопросы

1)В чем заключается сущность полимеразной цепной реакции?

2)Объясните устройство ПЦР лаборатории?

3)Принцип взятия биологического материала

4)Назовите основные этапы проведения ПЦР?

5)Объясните сущность метода горизонтального электрофореза?

6)Что такое внутренние контроли?

7)Сущность проблемы контаминации?

6. Указания к выполнению лабораторной работы

Чтобы приступить к лабораторной работе, необходимо пройти по ссылке https://www.hhmi.org/biointeractive/bacterial- identification-virtual-lab и на открывшейся странице нажать

кнопку . Или запустить программу с компьютера (ярлык Holiday Lectures). В новом окне откроется виртуальная лаборатория (рис. 6).

Рис. 6. Виртуальная лаборатория

21

6.1. Ход работы Часть 1. Подготовка образцов

Ключ к успешной идентификации – начать с «хорошего» образца. Многие патогенные бактерии плохо растут на твердой питательной среде, затрудняя идентификацию традиционными способами. Но даже плохо растущие бактериальные культуры могут быть идентифицированы с помощью методов, используемых в данной лаборатории.

Вы будете работать в хорошо оборудованной исследовательской больнице. Ваша задача – определить бактериальный образец, полученный от врача.

Предположим, что вам удалось вырастить на блюде для культивирования в твердой среде колонию бактерий. Первым шагом будет сбор одиночной колонии и ее помещение в микроцентрифужную пробирку (рис. 1).

Процесс извлечения бактериальной ДНК состоит в растворении клеточной стенки с помощью пищеварительного буфера (в бутылке с белой крышкой). Буфер содержит протеолитические ферменты, которые «съедают» клеточную стенку. Этот шаг может занять несколько часов.

Поскольку мы будем использовать другие ферменты на следующем этапе, поэтому, прежде чем продолжить, нам нужно избавиться от протеолитических ферментов. Для этого необходимо нагреть образец на водяной бане при 100 °С, в результате чего ферменты денатурируют. Затем клеточные осколки центрифугируются и на дне пробирки образуется твердый осадок. Необходимая нам ДНК содержится в надосадочной жидкости, которая затем переносится в пробирку для ПЦР.

Часть 2. ПЦР-амплификация

Шаг 1. Добавление мастер-микса Чтобы подготовить полимеразную цепную реакцию

(ПЦР), к нашей образцу ДНК необходимо добавить раствор

PCR Master Mix. В раство р еPCR Master Mix (пр о иркаб с красной крышкой) содержится следующее:

22

−вода;

−буфер для поддержания в смеси необходимого уров-

ня рН;

−большие количества четырех нуклеотидов: аденина, цитозина, гуанина и тимина;

−большие количества ДНК праймеров олигонуклеотида, которые связываются с областью 16S рДНК, чтобы инициировать процесс репликации;

−большие количества термостабильной ДНКполимеразы, которая расширяет цепь ДНК-копии.

Необходимо подготовить негативные и позитивные контрольные реакции. Вместо образца ДНК положительная реакция контроля содержит положительную контрольную ДНК (раствор 16S рДНК в пробирке с зеленой крышкой), а реакция отрицательного контроля содержит стерильную деионизированную воду. Обе реакции содержат раствор PCR

Master Mix.

Шаг 2. Запуск ПЦР Как только реакционные трубки загружаются в термо-

циклер («машина ПЦР»), начинается автоматический процесс репликации ДНК (рис. 2). Машина, используемая в этой лаборатории, имеет показания, которые описывают, что происходит (рис. 7).

Рис. 7. Показания (слева направо): температура, оставшееся время, номер цикла, расплав, отжиг и удлинение

Регулирование температуры осуществляется следующим образом:

• Начальная стадия инкубации: 95 °C в течение 10

минут

• 30 циклов следующей последовательности шагов:

23

−Расплав: 95 °C 30 секунд

−Отжиг: 60 °C 30 секунд

−Выдержка: 72 °C – 45 секунд

•Конечная стадия удлинения: 72 °C – 10 минут

•Конечная стадия: 4 °C – хранить при этой темпера-

туре

Во время каждого цикла первая стадия (расплав) заключается в разделении двойной спирали цепи ДНК путем нагревания пробирки, содержащей реакционную смесь ПЦР, до 95 °С в течение 30 секунд. Праймеры не могут связываться с цепями ДНК при такой высокой температуре, поэтому пробирка охлаждается до 60 ° C. При этой температуре праймеры связываются (отжигаются) с одноцепочечной ДНК. (Причина, по которой две отделенные нити ДНК не реагируют, состоит в том, что в растворе имеется большой избыток праймеров, поэтому более вероятно, что цепи ДНК свяжутся с праймерами, а не друг с другом). Конечная стадия (выдержка) заключается в том, чтобы позволить ДНК-полимеразе удлинить цепь ДНКкопии, повышая температуру до 70 °С в течение 45 секунд.

Три стадии – разделение нитей, отжиг праймера до матрицы и синтез новых нитей – занимают менее двух минут. Каждая из них проводится в одной пробирке. В конце цикла каждый фрагмент ДНК в пробирке удваивается. Цикл может повторяться 30 или более раз, и каждый вновь синтезированный фрагмент ДНК действует как новый шаблон. После 30 циклов может быть произведено около 1 млн. копий исходного фрагмента ДНК.

Часть 3. Очищение продукта ПЦР

Теперь пробирка должна содержать много копий рДНК 16s, каждая длиной около 1500 пар нуклеотидов (п.н.). В это время разумно запустить проверку гелем, чтобы подтвердить, что реакция ПЦР сработала. Гель должен содержать три полосы: одну для отрицательного контроля (т.е. воду), которая не должна содержать продукт, если вода не загрязнена; Другой для положительного контроля (продукт ПЦР с известной по-

24

следовательностью ДНК), чтобы убедиться, что сама ПЦР сработала; и последняя полоса для вашего образца.

Если вы уверены, что ПЦР сработала, вы можете приступать к очистке продукта ПЦР. Запуск геля на самом деле является одним из методов очистки. Как только продукт ПЦР находится в геле, вы можете вырезать полосу, соответствующую продукту ПЦР, и выделить ДНК из геля.

В окончательной инкапсулирующей трубке должно быть много фрагментов 16S рДНК длиной 1500 п.н. с очень небольшим количеством более длинных цепочек ДНК (которые являются загрязнителями).

Рис. 8. Очищение продукта ПЦР

Часть 4. Подготовка к секвенированию

Образец ДНК был очищен; Ваша пробирка для ПЦР теперь содержит практически только копии 16S рДНК. Теперь мы можем подготовить образец для автоматического достраивания цепочки ДНК. Преобладающий метод, проиллюстрированный здесь, называется секвенированием цикла ПЦР (рис. 3,

9).

25

В этой работе мы используем набор из 12 праймеров: по шесть для каждой цепи двухцепочечной ДНК. Теоретически возможно использовать один праймер в секвенировании цикла ПЦР, но это невозможно для длинных последовательностей. Кроме того, нет необходимости в абсолютной последовательно обеих цепочек, хотя это уменьшает ошибку. Точное количество и расположение праймеров, используемых в реакции, зависит от наличия подходящих праймеров. Таким образом, они должны быть способны связываться с последовательностью независимо от источника бактерий.

Каждая зеленая и голубая пробирка содержит смесь, состоящую из буферов, праймеров (разных в каждой пробирке), ДНК-полимераз, нуклеотидов и флуоресцентных меченых терминаторов в надлежащих пропорциях. Продукт ПЦР на предыдущем этапе добавляют в каждую пробирку и запускают другую ПЦР. На этот раз цель состоит не в том, чтобы произвести идентичные копии ДНК, а чтобы получить много копий переменной длины.

Рис. 9. Этап подготовки к секвенированию

26

Часть 5. Секвенирование ДНК

На последнем этапе у вас есть 12 пробирок, которые содержат конечный продукт ПЦР, смесь кусочков ДНК переменной длины. Все части ДНК в каждой пробирке начинаются

стого же праймера, но заканчиваются другим нуклеотидом, помеченным флуоресцентным маркером (различный цвет для каждого нуклеотида A, T, Г, Ц). Теперь предстоит выделить отдельные фрагменты ДНК и идентифицировать концевой нуклеотид.

Это делается с помощью автоматического секвенатора, который выполняет гель-электрофорез на ДНК в каждой пробирке (рис. 4). Гель-электрофорез является методом разделения молекул на основе различий в размерах. Секвенатор, используемый в этой лаборатории, имеет тонкую капиллярную трубку, прикрепленную на одном конце к механизму шприца, который содержит буферный раствор. Пробирку наполняют буферным раствором, а другой конец вставляют в одну из пробирок, содержащих фрагменты ДНК. Затем прикладывают электрический ток так, чтобы конец трубки, контактирующей

сДНК, имел отрицательный заряд, а шприц – положительный заряд. Поскольку молекулы ДНК отрицательно заряжены, они начинают перемещаться по трубке к положительно заряженному концу шприца, причем меньшие части движутся быстрее, чем более крупные. Около конца шприца капиллярная трубка проходит через лазерный луч, который возбуждает флуоресцентные маркеры, и оптические детекторы определяют цвет флуоресценции (рис. 5).

Можно предположить, что на предыдущем этапе был сформирован полный набор фрагментов ДНК, которые отличаются по размеру ровно на один нуклеотид. Самый маленький фрагмент ДНК, к которому прикреплен флюоресцентный маркер, является праймером. Этот фрагмент ДНК будет двигаться быстрее, чем другие. Читая этот цвет (в нашем примере, красный), мы определяем, что первый нуклеотид за пределами праймерной последовательности представляет собой тимидин (Т). Следующий маленький фрагмент ДНК будет

27

флуоресцировать зеленым цветом, представляющим следующий нуклеотид в последовательности (A) и т.д. Читая последовательность нуклеотидов на основе их флуоресценции, когда фрагменты ДНК проходят через лазерный луч, последовательность ДНК может быть восстановлена.

Секвенатор автоматически повторяет программу до тех пор, пока не будут исследованы все 12 пробирок. Результирующие наборы последовательностей сопоставляются компьютерной программой для построения полной последовательности гена 16S рРНК.

Часть 6. Анализ последовательности ДНК

После того, как информация о последовательности была собрана из всех реакционных пробирок, компьютер строит фактическую последовательность, соединяя вместе разные части. Теперь у вас есть последовательность 16S рДНК для данного вида бактерий, которую можно сравнить со всеми другими известными последовательностями 16S рДНК для идентификации.

Существует множество баз данных последовательностей. В этом примере мы будем использовать публичную базу данных GenBank, доступную через Национальную библиотеку медицины. Алгоритм сопоставления известен как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Прямое совпадение по-

следовательности ДНК определяет точные виды бактерий, которые вы обнаружили. Если последовательность ДНК не является точным совпадением, а близка к другой, найденной в базе данных последовательности, вам нужно оценить, является ли она новым видом или изменением уже существующего.

На последнем этапе необходимо выбрать правильный вариант из предложенных видов бактерий (рис. 10).

28