Занятие 22 Возбудители дифтерии, коклюша и паракоклюша

1.Возбудитель дифтерии: название по-латыни, морфология (форма, размеры, расположение, внутриклеточные включения)

Дифтерия (от греч. diphtheria – кожа, пленка) – острое инфекционное заболевание, характеризующееся токсическим поражением сердечно-сосудистой и нервной систем, а также специфическим фибринозным (дифтеритическим) воспалением в месте входных ворот.

Помимо возбудителя дифтерии в род Corynebacterium входят 20 видов, которые широко распространены в окружающей среде – воздухе, почве, воде, пыли, пищевых продуктах, а также большинство из них являются облигатными паразитами кожи, слизистых оболочек верхних дыхательных путей, ЖКТ и мочеполового тракта, условно-патогенными для человека и животных. Наиболее часто со слизистой оболочки носоглотки, с эпителия влагалища, а также из различных ран выделяют следующие виды: C. pseudodiphthericum (палочка Хофманна), С. хerosis и C. ulcerans (общее название дифтероиды=ложные дифтерийные палочки).

Таксономия. Семейство – Corynebacteriaceae Род – Corynebacterium Вид – C. Diphtheriae

Морфология и тинкториальные свойства. Прямые или слегка изогнутые палочки размером 0,3-0,8×1-6 мкм, спор не образуют, неподвижны, имеют микрокапсулу (в ее состав входит корд-фактор). Характерно взаимное расположение бактерий в мазке – под углом друг к другу в виде букв V, X, L, Y (неполное расхождение при делении). Ложные дифтерийные палочки располагаются параллельно друг другу. В толстых мазках располагаются в виде «пучка булавок» (от сюда произошло название коринебактерий: от греч. kоryne – булава). Булавидные утолщения на концах связаны с наличием зерен волютина (тельца Бабеша-Эрнста) – гранулы полиметафосфата. Могут образовывать фильтрующиеся и L-формы. Грамположительные микроорганизмы. При окраске по методу Нейссера цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а зерна волютина – в синий. По методу Леффлера (метиленовым синим) цитоплазма – голубая, зерна волютина – синего цвета. Также используется окраска флюорохромом – корифосфином с последующей люминисцентной микроскопией (цитоплазма дает желто-зеленое свечение, а зерна волютина – коричнево-красное).

2. На каких средах растёт палочка дифтерии? Токсинообразование. Методы выявления токсигенности. Что происходит с токсином под действием формалина и тепла?

Возбудители дифтерии – факультативные анаэробы, оптимальная температура их культивирования 370С, рН 7,3-8,0, длительность (8)12-24 часа. Требовательны к питательным средам (не способны расщеплять белки до аминокислот), для роста необходимо наличие аминокислот, минеральных веществ и металлов. Для культивирования применяются следующие среды:  Среда Ру (свернутая лошадиная сыворотка) и Леффлера (свернутая лошадиная сыворотка с добавлением глюкозы) – рост в виде серовато-кремовых сухих морщинистых колоний по типу «шагреневой кожи».  Среда Бучина с хинозолом – рост в виде плоские темно-синие колонии. Дифференциально-диагностическими являются среды с теллуритом (растут медленнее – 24-48 часов):  Наиболее часто используют глицериновокровяную среду с теллуритом (Клауберг II).  Сывороточно-теллуритовый агар с цистином (Тиндаль) и другие. На теллуритовых средах C. diphtheriae образует серовато-черные колонии, что обусловлено восстановлением теллурита до металлического теллура, имеющего черный цвет. Дифтероиды теллурит не восстанавливают.

Биохимическая активность. Дифтерийный палочки малоактивны. Каталазоположительны. Сбраживают с образованием кислоты глюкозу, мальтозу, галактозу, некоторые варианты ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, не разлагают сахарозу, лактозу и маннит. Не гидролизируют мочевину (проба Закса отрицательная). Разлагают цистеин с образованием сероводорода (проба Пизу положитеьная – коричневый ореол вокруг посева «уколом» за счет образования сернистого свина). Индол не образуют. На основании комплекса культуральных, биохимических и патогенетических свойств вид C. diphtheriae разделяется на 4 биовара: mitis, belfanti, gravis, intermedius.

Биовар mitis (легкий) характеризуется свойствами:  Не ферментирует крахмал, гликоген и декстрин;  Восстанавливает нитраты в нитриты;  На средах с теллуритом образует мелкие (1-2 мм) гладкие блестящие полупрозрачные черные колонии с ровным краем;  На жидкой среде дает равномерное помутнение и порошкообразный осадок;  На кровяных средах дает зону гемолиза;  Малотоксичен;  Вызывает легкую спородическую заболеваемость. Биовар belfanti: Сходен с биоваром mitis, но не восстанавливает нитраты (однако этот тест необязателен для идентификации, поэтому редко выделяют данный биовар) Биовар gravis (грубый) характеризуется следующими свойствами:  Ферментирует крахмал, гликоген и декстрин;  Восстанавливает нитраты в нитриты;  На средах с теллуритом формирует крупные (2-3 мм) сухие матовые плоские серо-черные колонии, приподнятые в центре, с радиальной исчерченностью и неровным краем (напоминают маргаритку);  На жидкой среде образуется пленка и крупнозернистый осадок (надосадочная жидкость прозрачная);  На кровяных средах не дает гемолиз;  Обладает выраженными токсигенными свойствами;  Выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии, вызывает групповые вспышки. Биовар intermedius трудноотличим от gravis, т.к. по биохимическим и культуральным свойствам сходен с биоваром gravis:  Не ферментирует крахмал (поэтому некоторые считают больше похожим на биовар mitis);  Расщепляет гликоген и декстрин;  На средах с теллуритом образует мелкие (< 1 мм) сухие матовые серо-черные колонии с неровным краем;  На жидкой среде дает помутнение с последующим образованием мелкозернистого осадка;  Гемолиз на кровяных средах отсутствует.

Токсины. Дифтерийная палочка выделяет мощный экзотоксин (гистотоксин), по силе занимающий 3-е место после ботулинического и столбнячного. Дифтерийный токсин оказывает цитотоксическое действие, а также обладает дермонекротическими и гемолитическими свойствами. Токсин синтезируется в виде неактивного предшественника – единого полипептида с молекулярной массой 61-63 кД. Активируется под действием собственной протеазы (либо протеаз макроорганизма), которая разрезает полипептид на два связанные между собой пептида: А (21 кД) и В (39 кД). Пептид В выполняет акцепторную функцию – распознает рецептор, связывается с ним, формирует внутримембранный канал, через который проникает в клетку пептид А. Пептид А – это фермент, который блокирует белковый фактор элонгации ЕF-2, что приводит к подавлению синтеза белка на рибосомах (клеток миокарда, ЦНС, почек и надпочечников). Подавление белкового синтеза в клетках миокарда и нервной системы приводит к демиелинизации нервных волокон и развитию парезов и параличей. Дифтерийный токсин синтезируют только C. diphtheriae, лизогенные toxпрофагом, несущим ген, кодирующий структуру токсина. Утрата клеткой профага или мутации в toxопероне делают клетку малотоксичной.