Dokument_Microsoft_Word_2

17. Ферменты бактерий: химическая природа, биологическая роль. Методы изучения ферментативной (протеолитической и сахаролитической) активности бактерий для их идентификации. Применение бактериальных ферментов в медицине.

Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.

2. Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.

3. Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.

4. Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.

5. Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).

6. Лигазы (синтетазы) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.

Ферменты бактерий подразделяются на экзо- и эндоферменты. Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов. Ряд экзоферментов являются ферментами агрессии (гиалуронидаза, коллагеназа и др.)

В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов.

Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. Ферментативный спектр является таксономическим признаком, характерным для семейства, рода и – в некоторых случаях- для видов. Поэтому определением спектра ферментативной активности пользуются при установлении ферментативной активности. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:

1 - гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления – кислоты, спирты, альдегиды, Н2О и СО2;

2 - протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода.

Для изучения активности ферментов при идентификации микроорганизмов широко используют дифференциально-диагностические среды, в состав которых входят определенные субстраты – сахара или белки.

Протеолитические ферменты у бактерий изучают на средах с желатином, молоком, сывороткой, пептоном и на некоторых полиуглеводных средах (среда Клиглера). Показателями глубокого расщепления белка является образование индола, аммиака и сероводорода.

Сероводород обнаруживают с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца, которую закрепляют между стенкой засеянной пробирки и пробкой (при взаимодействии сероводорода и ацетата свинца бумага чернеет в результате образования сульфида свинца), или на средах, в состав которых входят соли железа или свинца, которые при взаимодействии с сероводородом дают черное окрашивание самой среды или выросших колоний (среды Вильсона-Блера, Клиглера и т.д.)

Для обнаружения индола по способу Мореля узкие полоски фильтровальной бумаги, смоченные горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты и высушенные, помещают между стенкой пробирки с питательным агаром и пробкой. Другой, более чувствительный метод обнаружения индола позволяет концентрировать индол на поверхности среды ксилолом или эфиром, а добавление раствора Ковача (парадиметиламинобензальдегида) приводит к образованию красного кольца. Индол образуется при наличии у бактерий фермента триптофаназы.

Наличие аммиака определяют по посинению розовой лакмусовой бумажки, помещённой между стенкой и пробкой засеянной пробирки.

Желатиназа. При посеве уколом в желатин некоторые микробы (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и др.) при комнатной температуре (20-22°С) разжижают его, причём различные виды микробов дают характерную для них форму разжижения (послойно, в виде гвоздя, ёлочки и т.д.).

Другие протеолитические ферменты:

- при посеве на свёрнутую сыворотку вокруг колоний появляются углубления (разжижение)4

- в молоке происходит расщепление сгустка казеина с образованием пептона, в результате чего оно приобретает желтоватый цвет (пептонизация молока).

Тест окисления/ферментации глюкозы (в аэробных/анаэробных условиях) устанавливается на среде Хью-Лейфсона. В среде содержатся агар, соли, пептон, глюкоза и индикатор бромтимоловый синий. Посев осуществляют уколом в столбик питательной среды в две пробирки. Для создания анаэробных условий после посева среда в одной из пробирок заливается слоем стерильного вазелинового масла. Посев выращивают 3-4 суток. Образование кислоты из глюкозы изменяет зелёный цвет среды в жёлтый. При окислении глюкозы изменение цвета происходит в верхней части пробирки без вазелинового масла. При ферментации меняется цвет среды под слоем вазелинового масла (в анаэробных условиях). Тест используется для дифференциации аэробных бактерий от анаэробов и факультативных анаэробов. Аэробы (например, Pseudomonas aeruginosa) расщепляют глюкозу в аэробных условиях, то есть только окисляют глюкозу, но не ферментируют её; анаэробы (например, Clostridium perfringens) утилизируют глюкозу только в анаэробных (т.е. ферментируют). Факультативные анаэробы (например, Escherichia coli, Staphylococuss aureus) утилизируют глюкозу в аэробных и анаэробных условиях.

Для экспресс-метода определения ферментативной активности микроорганизмов применяются микротест-системы и системы индикаторные бумажные (СИБ).

Применение ферментов в медицине разнообразно. Протеолитические ферменты (трипсин, фибринолизин) применяют для обработки гнойных ран с целью расщепления погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалениях дыхательных путей, при тромбозах. Фермент гиалуронидазу, катализирующий расщепление гиалуроновой кислоты, используют для рассасывания рубцов после ожогов и операций. Аспарагиназа нашла применение для лечения лейкозов. Ферменты на твердом носителе применяют в анализе – ферментные электроды, тест-полоски и т.д.

39. Инфекционный процесс – определение понятия, условия развития. Патогенность и вирулентность микроорганизмов, единицы измерения вирулентности. Факторы вирулентности.

Под термином инфекция (от лат. Infection-заражение) или инфекционный процесс понимается процесс взаимодействия патогенного (болезнетворного) микроба и восприимчивого (чувствительного) хозяина в определенных условиях внешней среды.

Основу инфекции составляет феномен паразитизма, определяющий антагонистические взаимоотношения между организмами разных видов., при которых один вид – паразит использует другой вид – хозяина в качестве источника питания и места постоянного или временного обитания.

Крайним проявлением инфекционного процесса является инфекционная болезнь, при которой в чувствительном организме формируется патологический очаг и появляются клинические симптомы заболевания.

Для возникновения инфекционного заболевания необходимо сочетание следующих факторов:

• наличия микробного агента

• восприимчивости макроорганизма

• наличия среды, в которой происходит это взаимодействие

Патогенность (болезнетворность) - это генетически детерминированная потенциальная способность микроба вызывать инфекционный процесс у одного или нескольких видов организма хозяина. Патогенность является видовым признаком микроба.

Патогенные виды микробов способны вызывать инфекционный процесс у большинства особей популяции восприимчивого вида макро-организма.

Если же инфекция развивается только в условиях иммунодефицита, то виды микробов, вызывающие ее, называются условно-патогенными. Например, Escherichia coli. Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumonia.

Вирулентность – индивидуальный, штаммовый признак: степень (количественная мера) патогенности конкретного штамма по отношению к конкретному индивидууму – хозяину. По этому признаку все штаммы патогенного микроба данного вида могут быть подразделены на высоко-, умеренно-, слабо- и авирулентные.

Количественную оценку вирулентности штамма проводят на модели экспериментальной инфекции, определяя летальные дозы. Летальная доза (LD) – это наименьшее количество возбудителя или токсина, вызывающее в определенный срок гибель конкретного количества (%) животных, взятых в опыт. Единицами измерения вирулентности являются: DCL (лат.dosis certa letalis) смертельная доза, вызывающая 100% гибель инфицированных животных; LD₅₀ - количество бактерий, вызывающее гибель 50% животных в эксперименте; DLM (лат. dosis letalis minima) – наименьшее количество микробных клеток, способное вызвать гибель 95% животных восприимчивого вида определенной массы тела, пола, возраста, при определенном способе заражения и в течение заданного времени.

Факторы, обусловливающие вирулентность:

Токсигенность (греч. toxicum – яд и лат. genus – происхождение) – способность микроба образовывать токсины, которые вредно действуют на макроорганизм, путем изменения его метаболических функций.

Инвазивность (лат. invasio – нашествие, нападение) – способность микроба преодолевать защитные барьеры организма, проникать в органы, ткани и полости, размножаться в них и подавлять защитные средства макроорганизма. Инвазионные свойства патогенных бактерий обеспечиваются за счет микробных ферментов, так называемых факторов распространения (гиалуронидаза), капсул и других химических компонентов микробов. Это связанно с наличием специфических поверхностных структур, подавляющих фагоцитоз или активность комплимента, а также с особенностями метаболизма, обеспечивающих размножение возбудителя в организме хозяина.

Факторы адгезии или адгезивности и колонизации – факторы прикрепления микроорганизмов к чувствительным клеткам и способность заселять очаги первичного инфицирования. Функцию факторов адгезии могут выполнять фимбрии (микроворсинки 1-го порядка), белки наружной мембраны (белки-адгезины), липополисахариды клеточной стенки, липотейхоевые кислоты и другие структуры, которые могут располагаться на поверхности микроба либо входить в состав микроворсинок, капсул и клеточной стенки.

Антифагоцитарная активность - способность противостоять фагоцитозу. Она связана с капсулой патогенных микробов, с поверхностными белками (А-протеин стафилококка, М-протеин стрептококка), с полисахаридной слизью синегнойной палочки.

61. Синегнойной инфекции: названия возбудителей по латыни, морфология, отношение к окраске по Граму, питательные среды для культивирования, факторы вирулентности, вызываемые заболевания, материалы для исследования и методы лабораторной диагностики, препараты для специфической профилактики и лечения.

Таксономия. Псевдомонады относятся к роду Pseudomonas; типовой вид – P.aeruginosa (синегнойная палочка).

Морфология. P.aeruginosa – грамотрицательные подвижные палочки, которые не имеют спор, часто формируют капсулу, образуют пили 4-го типа.

Культурные и биохимические свойства. Синегнойные палочки – облигатные аэробы, обладают цитохромоксидазой. Они хорошо растут на простых питательных средах, выделяя пигмент – пиоцианин, который окрашивает питательную среду в сине-зелёный цвет. Возможно также образование пигмента другого цвета (жёлтого, чёрного, красного). При росте на питательных средах псевдомонады часто выделяют ароматические углеводороды, придающие культуре бактерий характерный сладковатый запах жасмина, сирени или карамели. Бактерии обладают термофильностью – могут расти при 42 °С.

Бактерии окисляют, а не ферментируют углеводы, поэтому они относятся к группе неферментирующих бактерий; имеют протеолитические ферменты. Псевдомонады продуцируют вещества, обладающие бактерицидными свойствами бактериоцины (пиоцины).

Антигенная структура. Синегнойные палочки имеют О- и Н- антигены; антигенными свойствами также обладают токсины, адгезины, пили и некоторые ферменты, выделяемые этими бактериями.

Факторы патогенности. P.aeruginosa имеют разнообразные факторы вирулентности: адгезины, эндо- и экзотоксины, ферменты агрессии (гемолизины, нейраминидазу, протеазу, эластазу, лейкоцидины и др.).

Эпидемиология. Заболевание синегнойной этиологии может развиться в результате аутоинфицирования (эндогенное заражение) или экзогенно. Источником инфекции являются люди (больные или бактерионосители). А также различные естественные резервуары природы и объекты внешней среды, в том числе в помещениях стационаров и аптек.

Механизмы и пути заражения при инфекциях, вызванных псевдомонадами, могут быть различными: возможны контактный, респираторный, кровяной или фекально-оральный механизмы заражения. Синегнойные палочки – частая причина внутрибольничных инфекций.

Патогенез и клиническая картина. Синегнойные палочки прикрепляются к различным клеткам организма с помощью пилей, продуцируют токсины и ферменты агрессии. От фагоцитоза бактерии защищены капсулоподобной слизью.

Синегнойные палочки вызывают у человека гнойно-воспалительные заболевания с различной клинической картиной: ожоговую болезнь, осложнения послеоперационных ран, эндокардиты, остеомиелиты, пневмонии, менингиты, абсцессы мозга, сепсис и др. Их часто выделяют из очагов воспаления в ассоциациях с другими условно-патогенными бактериями. Синегнойная палочка способна образовывать биопленки на поверхности медицинского оборудования.

Иммунитет изучен мало.

Микробиологическая диагностика. Исследуемый материал берут в зависимости от локализации воспалительного процесса и симптомов болезни. При бактериологическом исследовании чистую культуру выделенных бактерий идентифицируют по биологическим свойствам.

Обязательно определяют антибиотикограмму. Для внутривидовой идентификации бактерий проводят серотипирование, пиоцинотипирование, фаготипирование псевдомонад. Применяют также серологические методы исследованния (РА, РПГА, РСК). Лечение. Применяют антибиотики с учетом чувствительности бактерий к ним. Назначают также антисинегнойный гетерологичный Ig, антисинегнойную гипериммунную плазму человека, бактериофаг пиоцианеус или поливалентный жидкий пиобактериофаг.

Профилактика. Разработана ассоциированная вакцина, включающая антигены синегнойной палочки, протея и стафилококка. Эффективная стерилизация, дезинфекция и антисептика, а также соблюдение правил асептики являются основными мерами неспецифической профилактики синегнойной инфекции в стационаре. Среди профилактических мероприятий обязательны контроль обсемененности внешней среды (воздух, различные предметы, инструменты и аппаратура) и соблюдение правил личной гигиены.

Задача 1. Сыворотка, преципитирующая белок свиньи. Какой это препарат (лечебно-профилактический или диагностический); что содержит (антиген или антитело); как приготовлен; если препарат лечебно-профилактический, какое действие оказывает на макроорганизм; если диагностический, что обнаруживают с помощью этого препарата; дозируется ли этот препарат и в каких единицах, условия хранения?

1. Диагностический

2. Содержит АТ

3. Преципитирующие сыворотки получают гипериммунизацией животных (в данном случае свиней)

4. Преципитирующие сыворотки применяются для постановки реакций преципитации с целями диагностики некоторых инфекционных заболеваний, для определения природы неизвестного белка. Для выявления АГ в реакциях преципитации.

5. Титр

6. Хранят при температуре от +2 до +4 .