Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

в результате сочетания этих двух механизмов. В процессе проникновения вириона в клетку при участии клеточных ферментов происходит его депротеинизация, в ре-

зультате которой удаляются поверхностные структуры вируса, высвобождается его внутренний компонент (сердцевина, нуклеокапсид, нуклеиновая кислота).

Вирусная нуклеиновая кислота доставляется в соответствующие клеточные структуры и под действием лизосомальных ферментовклетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникальная биологическая структура: инфицированная клетка содержит 2 генома (собственный и вирусный) и 1 синтетический аппарат (клеточный).

При реализации внутриклеточной стадии жизненного цикла вирус осуществ-

ляет три молекулярных процесса: репликацию геномной нуклеиновой кислоты,

транскрипцию и трансляцию. На каждой стадии вирус вмешивается в клеточные синтетические механизмы и подчиняет их своим задачам, создавая приоритеты для вирусных нуклеиновых кислот.

Биосинтез вирусных компонентов осуществляется в разных частях клетки, по-

этому называется дизъюнктивным (от лат. disjunctus - разобщенный). Белки вируса синтезируются в результате транскрипции, т.е. переписывания информации с гено-

ма вируса на информационную РНК(иРНК) и последующей трансляции (считыва-

ние иРНК на рибосомах) с образованием белка вируса. Вирусная нуклеиновая ки-

слота кодирует синтез структурных и неструктурных белков вируса. Структурные белки входят в состав вириона, а неструктурные – являются ферментами и обеспе-

чивают репродукцию вируса. Одновременно с синтезом белка в клетке происходит и репликация (от лат. replicatio - повторение), т.е. синтез вирусных нуклеиновых ки-

слот.

Формирование вирионов происходит путем самосборки: составные части ви-

риона транспортируются в места сборки вируса в ядре или цитоплазме. Сборка ком-

понентов вириона происходит за счет гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия. В результате самосборки капсомеров, образовавшихся из вирусных полипептидов, и взаимодействия их с нуклеиновыми кислотами вируса образуются нуклеокапсиды. Суперкапсидная оболочка сложноорганизованных ви61

Консервативная и дисперсная модели репликации нуклеиновых кислот уста-

новлены только у вирусов. Полуконсервативная модель предполагает, что после первого раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, другая – синтезируемой заново. По такой схеме реплицируются виру-

сов, геном которых представлен двунитевой ДНК. При реализации консервативной модели репликации одна дочерняя молекула состоит из двух родительских цепей, а

другая – из вновь синтезированных цепей. Согласно консервативной модели репли-

цируются двунитевые РНК ротавирусов(семейство Reoviridae). ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся таким образом, неизвестны. Дисперсная модель репли-

кации приводит к образованию молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из фрагментов, как родительских цепей, так и вновь синтезированных. Дисперсная мо-

дель реализуется, например, на промежуточной стадии репликации онДНК-генома парвовирусов (семейство Parvoviridae).

Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затрав-

ки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у раз-

ных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК:

1 Инициация на внутренних участках ДНК– характерна для кольцевых мат-

риц. Затравкой служит олигорибонуклеотид, который может быть синтезирован ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой. Эти ферменты мо-

гут иметь клеточное происхождение, или быть вирус-специфическими. Синтезиро-

ваться может одна затравка или несколько затравок.

На однонитевой матрице затравка синтезируется на определенном участке,

узнаваемом ферментом. Двухнитевая матрица сначала подготавливается к инициа-

ции. На участке ori происходит присоединение хеликазы. Этот фермент расплетает участок матрицы, что приводит к образованию репликативной вилки с последую-

щим синтезом затравки.

2 Инициация на концах ДНК (терминальная инициация) – характерна для ли-

нейных матриц. Различают две группы способов концевой инициации ДНК-синтеза:

с использованием нуклеотидбелковой затравки и с использованием самозатравочно63

пи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Ско-

рость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./с.

4Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.

5Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.

6Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I – вносит раз-

рывы в одну цепь, топоизомераза II – вносит разрывы в обе цепи).

Терминация синтеза

1 Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, посколь-

ку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точкеori или при двуна-

правленной репликации в середине кольца 3'- и 5'-концы вновь синтезированной це-

пи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топои-

зомеразой.

2 В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образовани-

ем полной копии матричной цепи (рисунок 7).

В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатеме-

ра специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения.

Это приводит к образованию выступающих5'-концов и пробелов на 3'-конце, кото-

рые наращиваются ДНК-полимеразой. Бреши закрываются или путем репарации или лигирования.

Синтез полноразмерных линейных ДНК с инвертированными повторами на концах может быть завершен через образование шпильки. Инвертированные повто-

ры – это две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной моле-

кулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу ин-

вертированные повторы образуют палиндромы. На рисунке 7 показано, что терми-

нация 3'-конца через образование шпильки включает лигирование 3'-конца шпильки

65

с 5'-концом комплементарной цепи, внесение одноцепочечного разрыва с образова-

нием выступающего 3'-конца и его удлинение.

а.

б.

а – через образование конкатемеров; б – через образование шпильки Рисунок 7 – Схемы терминации синтеза линейных ДНК

3.7.1.2 Основные принципы и механизмы репликации РНК-геномов

РНК-содержащие вирусы – единственные известные создания природы, ис-

пользующие РНК в качестве генетического материала. Чтобы осуществить экспрес-

сию, репликацию и перенос генов, различные семейства РНК-содержащих вирусов развили разнообразные генетические стратегии и жизненные циклы, которые экс-

плуатируют биологию и биохимию их хозяев многими различными способами. Эти вирусы копируют свои геномы с использованием одного из двух уникальных био-

химических путей: или путем РНК-зависимого синтеза РНК(репликация РНК) или,

как ретровирусы, РНК-зависимого синтеза ДНК (обратная транскрипция), который сопровождается репликацией ДНК и транскрипцией. Эти пути требуют работы фер-

ментов, которые обычно отсутствуют в неинфицированных клетках-хозяевах. В свя-

зи с этим, данные ферменты должны быть генетически детерминированы вирусом и экспрессированы в течение инфекции. В некоторых семействах РНК-содержащих вирусов эти уникальные синтетические процессы необходимы на первых стадиях

66

инфекционного цикла, что требует наличия упакованных в вирион полимеразы и других ферментов, необходимых для осуществления следующего цикла инфекции.

Внутриклеточные места репликации РНК-геномов вирусов. Основная мас-

са РНК-содержащих вирусов реплицируется в цитоплазме. Однако известен ряд ис-

ключений из этого правила. В дополнение к ретровирусам, которые синтезируют ДНК копии своих геномов и встраивают их в клеточные хромосомы, ортомиксо- и

борнавирусы, чей геном представлен линейной (-)РНК, и кольцевая РНК вируса ге-

патита дельта, подобная вироидам растений, также реплицируются в ядре. Каждый компартмент клетки имеет свои возможности и резервы, определяемые доступно-

стью клеточных компонентов и биохимических путей, которые могут быть исполь-

зованы и скоординированы вирусами.

Уровни сегментации: гены, мРНК и белки. Разделение эукариотических кле-

ток на ядерные и эндоплазматические компартменты глубоко влияет на биологию вирусов. Рибосомы эукариот требуют метилированной кэп-структуры на5’-конце мРНК, которая играет критическую роль в передаче сигналов инициирования бел-

кового синтеза. В результате, эукариоты подчиняются правилу – «одна мРНК – одна полипептидная цепь», и, за немногими исключениями, каждая мРНК функциониру-

ет как отдельная единица трансляции. РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов обладают ограниченной способностью к взаимодействию с внутренними иниции-

рующими сайтами РНК-матриц, что создает проблему получения нескольких инди-

видуальных белков на основе единственного генома. В процессе эволюции различ-

ные семейства РНК-содержащих вирусов нашли три решения этой проблемы: фраг-

ментация на уровне белков, образование субгеномных мРНК, сегментация генома.

Например, РНК-вирусы семейств Picorna-, Toga-, Flavi- и Retroviridae для того, что-

бы получить функциональные белковые продукты используют протеолитическое расщепление полипротеина-предшественника. Вирусы других семейств– Сorona-,

Аrteri-, Rhabdo-, Paramyxoviridae – зависят от сложных механизмов транскрипции и чтобы произвести несколько различных моноцистронных мРНК с единственной РНКматрицы вынуждены синтезировать субгеномные мРНК. Представители се-

мейств Reo-, Orthomyxo-, Bunya-, Arenaviridae и др. решили проблему, фрагментируя

67

геномы. При этом вирионы содержат многократные доли генома, каждый из кото-

рых часто представлен единственным геном. У вирусов растений такие доли РНК генома могут пакетироваться в отдельные вирионы(явление мультипартитности),

требуя инфекции несколькими вирусными частицами для обеспечения инвазивной способности вируса, в то время, как сегменты генома вирусов животных обычно па-

кетированы совместно. Напротив, ДНК вирусы редко используют или сегментацию генома или синтез полипротеина. Это вероятно связано с относительной простотой синтеза моноцистронных мРНК, которая может быть транскрибирована с внутрен-

них промоторов на двунитевой ДНК и подвергнута альтернативному сплайсингу,

подобно ядерным транскриптам клетки.

Каждая разновидность РНК-генома имеет свои стратегии репликации, экс-

прессии генов и упаковки в вирионы.

Одно- и двунитевые РНК-геномы вирусов. Хотя все РНК-геномы реплици-

руются обычным способом комплементарного спаривания нуклеотидных оснований матрицы и дочерней нити, различные семейства РНК-содержащих вирусов реали-

зуют различные молекулярные стратегии репликативного цикла РНК и ее инкапси-

дации. Семейства однонитевых РНК-вирусов превосходят численностью семейства вирусов с двунитевой РНК геномом почти в 10 раз.

Чтобы ограничить накопление промежуточных репликативных форм, содер-

жащих области двунитевых РНК, вирусы разработали стратегии, различающиеся у

(+)РНК и (-)РНК. Все (+)РНК-содержащие вирусы синтезируют непропорционально низкие уровни негативных нитей – от 1 % до 5 % от уровня положительной РНК и таким образом минимизируют потенциал для накопления двунитевой РНК. Наобо-

рот, (-)РНК-вирусы нуждаются в существенных количествах(+)РНК нитей, чтобы использовать их в качестве матрицы для синтеза геномного потомства. Обычно (-

)РНК-вирусы предотвращают отжиг (+) и (-) нитей, сохраняя геномную РНК в со-

ставе нуклеокапсида.

(+)РНК и (-)РНК геномы. Различия между положительным и отрицательным РНК-геномами определяются полярностью нитей, инкапсидированных в вирионы.

(+)РНК-геном в начале инфекции использует синтезированные на рибосомах виру68

соспецифические белки и клеточные РНК-связывающие белки. После того, как син-

тезированные вирусоспецифическая РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) и дру-

гие неструктурные белки покидают рибосомы, начинается репликация РНК. Затем вновь синтезированные структурные белки вириона и РНК ассемблируют с образо-

ванием вирусного потомства. В противовес этому, (-)РНК-геномы и их антигеном-

ные комплементы остаются связанными с белками нуклеокапсида, как в пределах вирусных частиц, так и в течение всего цикла вирусной репликации. Эти фундамен-

тальные адаптационные различия основаны на том, что геномы положительной по-

лярности должны удовлетворять трансляционным критериям, которые диктуются клеткой-хозяином, в то время как негативные геномы и антигеномы должны удовле-

творять только матричным требованиям вирусоспецифическойRdRp, в связи с тем,

что они копируются, но никогда не транслируются. Хотя до настоящего времени ос-

тается неясным, как полимераза может копировать покрытые белком РНК-матрицы.

днРНК-геномы являются промежуточными между этими крайностями: родитель-

ские доли генома остаются изолированными в субвирусных частицах на протяже-

нии всего инфекционного цикла.

Однако следует учитывать, что положительные нити-предшественники двуни-

тевого РНК потомства изначально не инкапсидированы. Вероятно, эти вариации от-

ражают существенные различия в структурах вирусных комплексовRdRp-матрицах и в молекулярных механизмах репликации положительных, отрицательных и двуни-

тевых РНК-геномов.

Линейные и кольцевые РНК-геномы. Репликация РНК не только требует со-

хранения приемлемого уровня ошибок, как обсуждено ранее, но также должна избе-

гать систематических делеций или вставок нуклеотидов. Особенно подвержены из-

менениям концевые последовательности геномов, дублирование которых представ-

ляет проблему.

При репликации ДНК проблема терминации синтеза усилена тем, что ДНК-

полимераза не может начать синтез дочерней нити de novo, для чего требуется нали-

чие затравки. Это создает дополнительные сложности, связанные с копированием праймер-связывающей последовательности. Одним из нескольких известных, наи69