- •ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ
- •1. ВУГЛЕВОДИ
- •1.1. Йодометричний метод визначення глюкози
- •1.2. Визначення крохмалю поляриметричним методом за Еверсом
- •1.3. Йодометричний метод визначення лактози
- •2.1. Визначення кислотного числа
- •2.2. Визначення числа омилення
- •2.3. Визначення ефірного числа
- •2.4. Визначення йодного числа
- •2.5. Визначення перекисного числа
- •3. АМІНОКИСЛОТИ ТА БІЛКИ
- •3.1. Визначення амінокислот методом тонкошарової хроматографії
- •3.2. Визначення азоту амінних груп методом формольного титрування
- •3.3. Ізоелектрична точка білків
- •3.4. Осадження білків
- •3.4.1. Осадження білків солями важких металів
- •3.4.2. Осадження білків органічними розчинниками
- •3.4.3. Осадження білків реактивами на алкалоїди
- •3.4.4. Осадження білків концентрованими мінеральними кислотами
- •3.4.5. Осадження білків органічними кислотами
- •3.4.6. Осадження білків під час кип’ятіння
- •3.5. Кількісне визначення білка на основі біуретової реакції
- •3.6. Визначення відновленого глутатіону
- •3.7. Розділення білків та вивчення їх властивостей
- •3.8. Вивчення стійкості казеїн-кальцій-фосфатного комплексу
- •3.9. Визначення кальцію комплексонометричним методом
- •4.1. Кількісне визначення вітаміну В1 (тіаміну)
- •4.2. Якісне визначення вітаміну В2 (рибофлавіну)
- •4.3. Кількісне визначення вітаміну С у рослинній сировині
- •4.4. Кількісне визначення вітаміну С в молоці
- •4.5. Якісні реакції на вітаміни групи А
- •4.6. Кількісне визначення каротинів
- •4.7. Якісне визначення вітаміну D3 (холекальциферолу)
- •5. ФЕРМЕНТИ
- •5.1. Визначення специфічності дії ферментів
- •5.2. Якісне визначення дії β-фруктофуранозидази
- •5.4. Визначення амілолітичної (декстринуючої) активності.
- •5.5. Визначення протеолітичної активності
- •5.6. Визначення активності пероксидази
- •5.7. Визначення дегідрогенази
- •6. СПИРТОВЕ БРОДІННЯ
- •7. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ОРГАНІЧНИХ КИСЛОТ
- •7.1. Визначення летких кислот (у перерахунку на оцтову)
- •7.2. Визначення молочної кислоти
- •8. ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ДУБИЛЬНИХ РЕЧОВИН
- •9. ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ПЕКТИНУ ЗА КАЛЬЦІЙ ПЕКТАТОМ
- •10. СТАТИСТИЧНЕ ОПРАЦЮВАННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ
- •11. ЗАХОДИ З ТЕХНІКИ БЕЗПЕКИ В ЛАБОРАТОРІЇ
- •12. СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
- •12.1. Основна
- •12.2. Додаткова
- •ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ…………………………………………………….….......3
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ
БІОХІМІЯ
ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ
для студентів технологічних спеціальностей денної форми навчання
СХВАЛЕНО на засіданні кафедри
біохімії та екології харчових виробництв Протокол № 3
від 12.10.2010 р.
КИЇВ НУХТ 2011
Біохімія: Лабораторний практикум для студ. технолог. спец. ден. форми навчання / Уклад.: А.І. Салюк, А.В. Котинський, О.І. Семенова, Н.О. Бублієнко
– К.: НУХТ, 2011. – 61 с.
Рецензент: Ю.В. Данилович, канд. біол. наук
Укладачі: А.І. Салюк,
А.В. Котинський, О.І. Семенова,
Н.О. Бублієнко, кандидати техн. наук
Відповідальний за випуск Л.В. Левандовський, д-р техн. наук, проф.
Видання подається в авторській редакції
2
|
ЗАГАЛЬНІ ВІДОМОСТІ |
|
Методичні вказівки призначені для виконання |
лабораторних робіт |
|
студентами технологічних спеціальностей з метою ознайомлення з основними |
||
методами |
біохімічних досліджень амінокислот, білків, ліпідів, вуглеводів, |
|
ферментів, вітамінів та процесами обміну цих речовин у живих організмах. |
||
Для засвоєння теоретичних основ біохімічних методів, розвитку навичок |
||
самостійної |
роботи, свідомого підходу до вивчення |
матеріалу викладено |
короткий теоретичний вступ до кожної із запропонованих методик.
Перед виконанням роботи кожен студент повинен уважно ознайомитись з методикою проведення роботи, зрозуміти хімічну суть і практичне значення
досліджень. |
Виконану |
роботу |
потрібно оформити у протоколі: описати |
||
принцип |
її |
проведення |
або |
хімізм перебігу реакцій, хід |
роботи. Під час |
виконання |
роботи в протоколі |
простежуються видозміни, які |
відбуваються з |
об’єктами під час досліджень. У разі кількісного аналізу роблять відповідні розрахунки і занотовують кінцевий результат, при якісному аналізі записують відповідні висновки.
1. ВУГЛЕВОДИ
Вуглеводи – це численна і поширена у природі група органічних сполук, необхідних для життєдіяльності тваринних і рослинних організмів.
Вуглеводи поділяють на дві групи: прості та складні.
Прості вуглеводи (моносахариди) являють собою багатоатомні альдегідоабо кетоспирти (альдози або кетози). За кількістю атомів карбону прості вуглеводи поділяються на тріози, тетрози, пентози, гексози тощо. Прості вуглеводи – це кристалічні речовини, добре розчинні у воді, оптично активні, багато з них солодкі на . смакМають відновлювальні властивості, що використовується для їх якісного та кількісного визначення.
Складні вуглеводи (полісахариди) утворюються із залишків моносахаридів, які перебувають у циклічній формі. Складні вуглеводи поділяють на дві групи:
1) олігосахариди – мають у своєму складі 10до залишків простих
3
вуглеводів. Залежно від кількості цих залишків, олігосахариди поділяють на ди-, три-, тетрасахариди тощо.
Найбільше значення мають дисахариди. За будовою та властивостями їх поділяють на відновлювані (лактоза, мальтоза) та невідновлювані (сахароза);
2) полісахариди – вуглеводи з великою молекулярною масою(досягає кількох мільйонів). Вони являють собою довгі ланцюжки із залишків циклічних форм простих вуглеводів, з’єднаних глікозидними зв'язками. Ці ланцюжки можуть бути як розгалужені, так і нерозгалужені.
Полісахариди поділяють, у свою чергу, на дві підгрупи:
а) гомополісахариди – побудовані із залишків одного простого вуглеводу (крохмаль, глікоген, клітковина, інулін тощо);
б) гетерополісахариди – до їх складу входять залишки різних вуглеводів та їх похідних (геміцелюлози, камеді, рослинні слизи, мукополісахариди тощо).
Вуглеводи мають велике значення для живого організму. Вони є енергетичним і будівельним матеріалом, використовуються у різноманітних процесах обміну речовин. За зміною їх вмісту і складу у тканинах роблять висновок про стан організму, а в харчових продуктах – про умови їх зберігання
та якість. |
|
|
|
|
|
|
|
Вуглеводи |
– основний |
компонент |
сировини |
для |
|
хлібопекарського, |
|
макаронного |
та |
кондитерського |
виробництв, бродильної, |
цукрової |
|||
промисловості |
тощо. |
Вони не |
лише складові частини, |
й |
фактори, що |
підвищують смакові властивості та поживну цінність харчових продуктів, а отже мають важливе технологічне значення.
1.1. Йодометричний метод визначення глюкози
Глюкоза – один із найпоширеніших моносахаридів. У великій кількості міститься у дозрілому винограді, тому ще має назву виноградний цукор. Міститься у фруктах та ягодах, входить до складу мальтози, сахарози, лактози, рафінози. З глюкози побудовані полісахариди – крохмаль, клітковина, глікоген.
Мета роботи: засвоєння йодометричного методу визначення глюкози. Завдання на виконання роботи: визначити вміст глюкози у дослідних
зразках.
Апаратура: технічні терези; лабораторна центрифуга; годинник. Лабораторний посуд: мірні колби місткістю100 мл; колби Ерленмейєра;
піпетки; бюретки для титрування; лійки для фільтрування; гумові пробки; скляні палички.
Матеріали та реактиви: 0,1 н розчин йоду; 0,1 н розчин натрій тіосульфату; 1 н розчин сульфатної кислоти; 0,1 н розчин натрій гідроксиду; 1,0 %-й розчин індикатора (крохмаль); фільтрувальний папір.
Принцип методу ґрунтується на здатності йоду в лужному середовищі окиснювати лише альдози, не впливаючи на кетози.
CH2OH(CHOH)4COH+J2+3NaOH ® CH2OH(CHOH)4COONa+2NaJ+2H2O;
Це рівняння складається з двох реакцій:
J2 + 2NaOH ® NaOJ + NaJ + H2O; CH2OH(CHOH)4COH+NaOJ+NaOH ® CH2OH(CHOH)4COОNa+NaJ+H2O
Йод, який не прореагував із глюкозою, визначають титруванням розчином
4
натрій тіосульфату у кислому середовищі. Ця реакція також відбувається в дві стадії:
NaOJ + NaJ + H2SO4 ® J2 + Na2SO4 + H2O
J2 + 2Na2S2O3 ® 2NaJ + Na2S4O6
Хід роботи. Ретельно подрібнену наважку речовини(1 г) переносять у мірну колбу місткістю 100 мл, розчиняють у воді, доводять до позначки. Вміст колби фільтрують або центрифугують, з прозорого розчину в колбу Ерленмейєра відбирають 10 мл, що відповідає наважці 0,1 г вихідної речовини.
У колбу додають 25 мл 0,1 н розчину йоду і через 2 – 3 хв при енергійному перемішуванні повільно додають35 мл 0,1 н розчину натрій гідроксиду до зникнення забарвлення. Колбу закривають гумовою пробкою і витримують20 хв у темному місці. Потім додають 5 мл 1 н розчину сульфатної кислоти і титрують йод, що виділився, 0,1 н розчином натрій тіосульфату, додаючи в
кінці |
титрування |
розчин |
крохмалю(індикатор). Паралельно |
проводять |
контрольний дослід з 10 мл дистильованої води. |
|
|||
Кількість глюкози, %, обчислюють за формулою: |
|
|||
|
|
Г = (А - В)× 0,009 ×V1 ×100%, |
(1.1) |
|
|
|
|
n ×V2 |
|
де А і В – кількість натрій тіосульфату, витраченого на титрування відповідно контрольної і дослідної проб, мл; 0,009 – кількість глюкози, еквівалентна 1 мл 0,1 н розчину йоду, г/мл (молекулярна маса глюкози 180, еквівалент 90, титр 0,1 н); n – наважка, г; V1 – об'єм розчинення наважки, мл; V2 – об'єм, взятий для титрування, мл; 100 – коефіцієнт перерахунку у відсотки.
Аналізують одержані результати, складають висновки і рекомендації.
1.2. Визначення крохмалю поляриметричним методом за Еверсом
Крохмаль – резервний полісахарид рослин, побудований з амілози та амілопектину. Амілоза складається із залишків -αD-глюкози, з'єднаних 1 – 4 глікозидними зв'язками і являє собою нерозгалужений полімерний ланцюг. Амілопектин є розгалуженою структурою, побудованою із залишків -Dα- глюкози, і має 1 – 4 зв'язки, а за місцем розгалуження 1 – 6 зв'язки.
Контроль якості сировини, яка містить крохмаль, а також проміжних і кінцевих продуктів його гідролізу має велике значення для крохмале-патокової, хлібопекарської та спиртової промисловості. Визначення крохмалю за Еверсом належить до поляриметричних методів.
Мета роботи: засвоєння методу визначення крохмалю у сировині.
Завдання на виконання роботи: визначити вміст крохмалю у сировині харчових виробництв.
Апаратура: поляриметр; технічні терези; піпетки; водяна баня; годинник. Лабораторний посуд: мірні колби місткістю100 мл; лійки для
фільтрування.
Матеріали та реактиви: 1,125 %-й розчин хлоридної кислоти; 10 %-й
розчин таніну; |
25 %-й |
розчин плюмбум |
оцтовокислого; 25 %-й |
розчин |
|
хлоридної кислоти; насичений розчин |
натрій сірчанокислого; фільтрувальний |
||||
папір; картопля. |
|
|
|
|
|
Принцип |
методу |
ґрунтується |
на |
гідролізі крохмалю |
розбавленою |
5
хлоридною кислотою, осадженні білкових речовин і визначенні кута обертання поляризованого світла за допомогою поляриметра.
Хід роботи: 5 г досліджуваного продукту(подрібненої картоплі тощо) переносять у мірну колбу місткістю100 мл і додають 50 мл хлоридної кислоти концентрацією 1,125 %. Колбу вміщують у киплячу водяну баню на15 хв; перші 3 хв вміст колби часто переміщують. Потім колбу виймають, додають у неї воду до загального об'єму 80 – 90 мл і охолоджують до температури 20 °С.
Для осадження білків і освітлення розчину додають0,5 – 1,0 мл 25 %-го розчину плюмбум оцтовокислого. Після осадження білків розчин у колбі доводять водою до позначки, ретельно перемішують і фільтрують через складчастий фільтр. Перші порції фільтрату виливають. Фільтрат поляризують
у поляриметричній |
трубці завдовжки200 |
мм. Одержані за |
допомогою |
поляриметра значення |
перемножують на |
коефіцієнт1,78 або |
на 5,1 при |
поляризації з круговою шкалою. Одержане значення і є вмістом крохмалю в досліджуваному продукті (у відсотках).
Досліджувані продукти часто, крім крохмалю, містять ще й розчинні оптично активні вуглеводи. Значна їх кількість наявна у мерзлій картоплі, лежалих продуктах рослинного походження, ураженій хворобами картоплі. При аналізі таких продуктів вносять поправку на розчинні вуглеводи.
У мірну колбу на100 мл вміщують 10 г подрібненого продукту, приливають близько 75 мл води і при частому перемішуванні витримують30 хв, потім додають 5 мл 10 %-го розчину таніну. Вміст колби перемішують,
після чого додають5 мл плюмбум оцтовокислого і доводять до позначки насиченим розчином натрій сірчанокислого. Потім вміст колби ретельно збовтують і фільтрують, 50 мл фільтрату переносять у мірну колбу місткістю 100 мл, додають 2,5 мл 25 %-ної хлоридної кислоти і ставлять у киплячу водяну баню на 15 хв. Після цього колбу охолоджують, додають 0,5 – 2,0 мл 25 %-го розчину плюмбум оцтовокислого, доливають водою до позначки, збовтують, фільтрують. Фільтрат поляризують у поляризаційній трубці завдовжки200 мм. Одержаний результат віднімають від показання поляриметра при першому
визначенні, а різницю множать на коефіцієнт Еверса для картопляного крохмалю.
Приклад 1. Взято 5 г наважки в колбі місткістю100 мл. При поляризації в поляриметрі (трубка завдовжки 200 мм) знайдено кут обертання площини поляризації 10,5°.
Вміст крохмалю в наважці, %;
10,5 ×1,78 =18,7%
Якщо умови визначення інші(наважка, вміст колби, довжина трубки), результат відповідно перераховують. Наприклад, для дослідження взято20 г наважки, колба місткістю 100 мл, поляризація фільтрату проводилась у трубці завдовжки 100 мм.
Поправка на довжину трубки: 200/100=2. Результат за формулою треба збільшити в 2 рази.
Поправка на наважку 20 : 5= 4. Результат за формулою слід зменшити у4 рази.
6