Методичка Абсорбция пигментов растений
.pdfРуководство по выполнению лабораторной работы
«Абсорбционная спектроскопия пигментов растений»
1 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Изучите теорию на стр. 59-76 «Практикума по общей биофизике» (Холостова, Фишов,
2002)
2 ИЗУЧИТЕ ПРИНЦИП РАБОТЫ ПРИБОРА:
Аппаратура для измерения поглощения в видимом и ультрафиолетовом свете
Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов.
Несмотря на различия в конструкции, все спектрофотометры состоят из источника света,
монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света (как правило, состоящего из фотоэлектронного умножителя ФЭУ) и системы вывода данных (компьютер, дисплей, реже – самописец) для регистрации выходного сигнала детектора (рис. 11).
Рис. 11. Принципиальная схема устройства спектрофотометра.
Свет от лампы 1 проходит сквозь монохроматор 2 для выделения пучка света с определенной длиной волны. Монохроматичный свет проходит сквозь кювету с образцом 3 или растворителем 4,
помещенные в держатель для кювет 5, затем попадает на регистрирующее устройство (ФЭУ) 6, сигнал с которого передается измерительному прибору 7.
Ход работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через кювету сравнения, наполненную растворителем, в котором приготовлен образец (например, буфер или вода), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении
растворенного вещества. Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся в различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучений.
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1Ознакомьтесь с инструкцией по работе на спектрофотометре Genesys 10S (Thermo Scientific, США).
3.2Регистрация спектров поглощения пигментов
Возьмите лист растения, разделите его на 3 части: 1-ая часть будет исследована в целом виде, из 2-ой части следует приготовить водный гомогенат, а из 3-ей – ацетоновый экстракт (согласно инструкции в задании 2 на стр. 84-86 «Практикума по общей биофизике»).
Зарегистрируйте спектры поглощения растительных пигментов в трех образцах:
-целом листе (расположите кусок листа вдоль прозрачной стенки кюветы)
-водном гомогенате (в кювету достаточно налить 2 мл, раствор должен быть не слишком густо окрашенный, не мутный)
-ацетоновом экстракте (в кювету следует налить 2 мл)
Условия регистрации: диапазон сканирования - 400-750 нм, шаг сканирования – 2 нм/с.
3.3 Проверка закона Бугера-Ламберта-Бера:
Измерьте спектры люминесценции пигментов в ацетоновом экстракте,
разведенном в 2, 4, 8, 16 и 32 раза. Для этого заберите из кюветы 1 мл исходного экстракта и добавьте 1 мл ацетона (получили разведение ½). Перемешайте содержимое кюветы и измерьте спектр (условия аналогичные п. 3.2). Повторив данную манипуляцию еще 4 раза,
получите спектры разведений ¼, 1/8, 1/16, 1/32 и 1/64.
3.4 Вычисление концентраций хлорофиллов а и б
Выберите из отснятых в предыдущем задании спектров один такой, у которого Dmax < 1.
Используйте его для вычисления концентраций хлорофиллов а и б согласно формулам на стр. 87 «Практикума по общей биофизике». Исходя из полученных значений, рассчитайте концентрации хлорофиллов для всех остальных ацетоновых экстрактов.
4.СОСТАВЛЕНИЕ ОТЧЕТА
4.1Предоставляемый для отчета материал
Диаграмма 1: Спектры поглощения пигментов в 3-х средах: целом листе, водном гомогенате, ацетоновом экстракте.
Диаграмма 2: Спектры поглощения пигментов в ацетоновом экстракте: исходный экстракт и все разведения.
Диаграмма 3: Зависимость максимального поглощения ацетонового экстракта от концентрации Dmax(C) (брать длинноволновый максимум).
Таблица 1: Параметры измеренных спектров поглощения:
№ |
Образец |
1max, нм |
D1max |
2max, нм |
D2max |
CХлА |
СХлБ |
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
Целый лист |
… |
… |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
… |
… |
… |
… |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
4.2 Что, как минимум, следует проанализировать в отчете и вынести в выводы:
1)Спектры каких пигментов Вы наблюдали в эксперименте (воспользуйтесь Приложением 1)
2)Как смещается максимум поглощения пигментов при переходе от целого листа к водному гомогенату и ацетоновому экстракту? Почему?
3)Рассчитайте энергию возбужденного состояния (в см-1) в каждом образце.
4)Смещается ли максимум поглощения пигментов в ацетоновом экстракте при уменьшении концентрации? Если да, то почему?
5)Выполняется ли закон Бугера-Ламберта-Бера для ацетонового экстракта? Если выполняется не на всем диапазоне концентраций, то по какой причине нарушается? Какой диапазон концентраций пригоден для проведения количественного анализа?
ПРИЛОЖЕНИЕ 1