как увеличивается неупорядоченность распределения ионов Na+ и Cl-, когда они из кристаллов поваренной соли (твёрдой фазы) переходят в жидкую фазу [6].
Свободную энергию можно вычислить по следующей формуле:
∆G = –RTlnKeq, где R – универсальная постоянная (1,987 кал/моль•град), T – абсолютная температура (равна 298 при 25 о С), ln – логарифм при основании е, Keq – константа равновесия.
Keq вычисляется по формуле: Keq = [AB]/([A]•[B]), где К – константа равновесия, [AB], [A], [B] – концентрация молекул AB, A и B в моль/л в реакции А + В → АВ.
Свободная энергия связана с энтропией следующим уравнением:
∆G = ∆H – T∆S, где ∆S – разница в энтропии между продуктами реакции и исходными веществами (кал/град), ∆H – разница в энтальпии (энергии, которая доступна для преобразования в теплоту) между продуктами реакции и исходными веществами, T – абсолютная температура.
Вернёмся к примеру с поваренной солью. При растворении в воде поваренной соли ΔН – величина положительная, температура в сосуде с раствором, т. е. в объеме раствора, снижается. Тем не менее процесс идет спонтанно, поскольку степень упорядоченности системы уменьшается. В исходном состоянии ионы Na+ и Сl- занимали фиксированные положения в кристаллической решетке. В растворе они перемещаются независимо друг от друга в произвольных направлениях. Снижение упорядоченности (ΔS > 0) означает, что член уравнения -TΔS имеет знак минус. Это компенсирует ΔН и в целом ΔG – величина отрицательная.
Информация и энтропия
За 20 лет до появления работ К. Шеннона анализом информации занимался венгерский физик Лео Сциллард, в связи с решением одного термодинамического парадокса, предложенного Джеймсом Максвеллом еще в прошлом веке. Смысл парадокса Максвелла заключается в следующем. Изолированная система, состоящая из разделенного на две части резервуара с газом и с дверцей в перегородке, содержит также "демона" (существо или автомат), наделенного способностью отличать быстрые молекулы от медленных. Демон открывает дверцу только в том случае, если к ней справа подлетает быстрая молекула. Поэтому газ в левой части резервуара будет нагреваться, а в правой – остывать (рис. 6). Таким образом, в изолированной системе тепло будет переходить от холодного тела к горячему с понижением энтропии системы в противоречии со вторым законом термодинамики. А второе начало термодинамики гласит: не существует процесса, единственным результатом которого является передача тепла от холодного тела горячему (постулат Клаузиуса). Что же сделал Сциллард? Он обратил внимание на необходимость получения информации о молекулах и открыл связь между информацией и термодинамическими характеристиками. Таким образом, информацию нельзя получать бесплатно. За нее приходится платить энергией, в результате чего энтропия системы повышается на величину, по крайней мере, равную ее понижению за счет полученной информации.
10
Пусть задано макроскопическое состояние некоторой системы, то есть с определенной степенью точности указаны значения таких параметров, как объем, давление, температура, химический состав и т.п. Каждому макросостоянию системы соответствует набор микросостояний. В микросостоянии прецизированы (точно заданы) состояния всех частиц, входящих в систему. Для любой макросистемы при температуре выше абсолютного нуля число микросостояний W , соответствующих данному макросостоянию, огромно. W называется статистическим весом или термодинамической вероятностью данного макросостояния. Согласно основному постулату статистической физики, все W микросостояний, соответствующие одному макросостоянию, имеют одинаковую априорную вероятность. Знать микросостояние системы — значит знать о системе все!
Рисунок 6. Схема, отображающая парадокс Максвелла (пояснение в тексте)
Величина W непосредственно связана с энтропией. По формуле ПланкаБольцмана S = klnW, где размерная постоянная Больцмана k = 1,38•10-16 эрг/град или 3,31•10-24 эе (эе — энтропийная единица, 1 эе = 1 кал/град). Рассчитаем, какое количество информации надо получить о системе, находящейся в данном макросостоянии, чтобы однозначно определить ее микросостояние. Иначе говоря, какого количества информации недостает для полного описания системы в заданном макросостоянии? Пусть микросостояние определено путем измерений или расчетов (на самом деле сделать это нельзя). До определения вероятности того, что макроскопическая система находилась именно в этом микросостоянии, была равна 1/W, а после определения стала
равной единице. Полученное количество информации составляет I = log2W.
Формулы S = klnW и I = log2W совпадают с точностью до постоянного размерного множителя. Величины I и S существенно идентичны. Энтропия системы в данном макросостоянии есть количество информации, недостающее до ее полного описания. Чтобы перейти от количества информации в битах к энтропии в энтропийных единицах, необходимо перейти от логарифма при основании 2 к натуральному логарифму и умножить на k : S = 2,3•10-24 I. Данное уравнение выражает связь между энтропией и информацией [2].
11
Биологическая упорядоченность нуклеиновых кислот
Посчитаем, сколько стоит упорядоченность генома человека. Геном человека
состоит приблизительно из 3,2•109 пар оснований. Таким образом, используя формулу Хартли, находим количество информации, необходимое для того,
чтобы узнать последовательность генома человека – 6,4•109 бит. В пересчёте на энтропию получаем для генома человека значение уменьшенной энтропии – около 1,5•10-14 эе. Для сравнения, при испарении одного грамма воды энтропия повышается примерно на 1 эе, которая может скомпенсировать пониженную энтропию. Эти оценки показывают, что возникновение и усложнение биологической организации происходит практически «бесплатно». Все разговоры об антиэнтропийных тенденциях биологической эволюции основаны на недоразумении. Согласно физическим критериям, любая биологическая система упорядочена не больше, чем кусок горной породы того же веса. Хотя эти оценки не могут быть оспорены, они вызывают чувство неудовлетворенности. Ведь без всяких расчетов поразительная упорядоченность биологических структур и процессов совершенно очевидны. Если физика говорит, что эта упорядоченность ничего не стоит, то хочется ответить: тем хуже для физики. Интуитивно чувствуется, что биоструктуры обладают особой упорядоченностью, измерять которую в энтропийных единицах, конечно, можно, но многого для понимания особенностей живой материи при этом не стоит ожидать. В основе ощущения особой упорядоченности биологических структур лежит то обстоятельство, что она имеет смысл [2]. Но также нужно понимать, что только определённая комбинация атомов жизнеспособна, поэтому «бит биту рознь». Для организма с точки зрения физики ничего не стоит упорядочивать молекулы в клетке, но обнаружение того как именно упорядочивать молекулы бесценно, а на это ушли миллиарды лет эволюции всего живого. Попробуем показать, что могло управлять процессом создания определённых последовательностей нуклеиновых кислот.
Смысл биологической упорядоченности нуклеиновых кислот
Пусть в обширном водном резервуаре растворено большое количество дезоксинуклеозидтрифосфатов – кирпичиков, из которых строится ДНК. Присутствуют четыре типа дезоксинуклеозидтрифосфатов: содержащих аденин (А), гуанин (G), цитозин (C) и тимин (Т). Между дезоксинуклеозидтрифосфатами могут идти реакции конденсации с образованием однонитевых ди-, три- и т.д. полинуклеотидов. Скорость распада ди-, три-, ... полинуклеотидов значительно больше скорости их образования, и равновесие в этих реакциях будет сдвинуто в сторону мономеров. Небольшое число полимерных нитей разной длины, которые всегда будут присутствовать в растворе в динамическом равновесии с огромным избытком мономеров, должно иметь совершенно случайные последовательности нуклеотидов (скорости реакций распада и синтеза для всех нуклеотидов практически одинаковы), и априорные вероятности всех последовательностей будут
12
одинаковы. Ясно, что та или иная реализующаяся последовательность, та или иная возникающая упорядоченность не будут иметь смысла. Однако благодаря особым химическим свойствам нуклеотидов (возможность образования водородных связей между ними), помимо перечисленных выше реакций образования однонитевых цепочек, могут идти реакции присоединения цепочки других нуклеотидов и образование новой цепочки, связанной с первой. Этот процесс называется матричным синтезом. Последовательность нуклеотидов в новой цепочке полностью определяется последовательностью в исходной цепочке: против аденина (А) всегда стоит тимин (Т), а против гуанина (Г) – цитозин (Ц) (правило Чаргаффа).
Возникающая в результате матричного синтеза молекула двунитевого полимера гораздо стабильнее молекулы однонитевой. По достижении достаточной длины она образует двойную спираль, практически не распадается и может успеть "реплицироваться", нарастив на обе нити соответствующие нуклеотиды. Первая двунитевая молекула образуется в результате случайного и весьма маловероятного процесса. Последовательность нуклеотидов в этой однонитевой молекуле могла быть любой. Однако после того, как двунитевая структура образовалась, ситуация резко изменилась (рис. 7). Последовательность, реализованная в таком долгоживущем двунитевом полимере, приобрела смысл.
Рисунок 7. Схема самовоспроизводящейся системы нуклеиновых кислот
Этот смысл состоит в том, что эта последовательность в стабильной и способной к репликации молекуле существует, а другие возможные последовательности – нет. В системе будет быстро возрастать концентрация полимеров именно с такой, теперь уже особой, последовательностью. Случайные отклонения («ошибки») от «правильной» последовательности будут также воспроизводиться и дадут начало самостоятельным системам, конкурирующим с исходной за запасы мономеров. Таким образом, благодаря запоминанию случайного выбора возникла упорядоченность, имеющая смысл, возникла система, способная создавать осмысленную информацию.
13
Этот пример стабильной самовоспроизводящейся системы нуклеиновых кислот ни в коем случае не претендует на то, чтобы его связывали с происхождением жизни на Земле. Это просто попытка продемонстрировать наиболее существенные характеристики процесса создания осмысленной упорядоченности на примере биополимеров с использованием некоторых хорошо известных их свойств. В этом примере речь шла именно о создании новой информации. До того, как полимер со случайной последовательностью нуклеотидов образовал стабильную двунитевую структуру, информации о том, что эта последовательность "лучше" других, просто не существовало. Информация была создана, сотворена. Сквозь случайность просочилась закономерность. Системы, создающие осмысленную упорядоченность, обладают одним общим свойством: они содержат компоненты, конструкции, продолжительность жизни которых превышает время одного цикла работы системы. Для системы нуклеиновых кислот это значит, что двунитевой полимер не распадется до репликации. Требование наличия долгоживущих, медленно релаксирующих конструкций обязательно для живой материи [2].
Сколько нужно информации, чтобы управлять экспрессией генов, которые попали в матрицу геномной ДНК? Попробуем ответить на этот вопрос.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ ТЕОРИИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ (ДНК-ИНСЕКТИЦИДЫ)
ДНК-инсектициды – препарат на основе коротких одноцепочечных фрагментов ДНК, используемый для регуляции численности листогрызущих насекомых.
Впервые инсектицидная активность фрагментов ДНК была показана на гусеницах непарного шелкопряда I и II личиночных возрастов при использовании двух одноцепочечных участков антиапоптозного гена вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда IAP-3 длиной 18 нуклеотидов каждый. На поверхность тела гусеницы наносилась капля воды в 0,5 мкл с растворёнными в ней фрагментами ДНК в концентрации 100 пмоль/мкл, т.е. приблизительно по 15 триллионов каждого из двух фрагментов ДНК (рис. 8).
Рисунок. 8. Гусеница непарного шелкопряда I-го личиночного возраста с каплей исследуемого раствора на поверхности тела (а)
Для исследования были выбраны два фрагмента ДНК из относительно консервативного домена BIR (смысловая цепь) и высоко консервативного домена RING (антисмысловая цепь) IAP-3 гена вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда. Последовательности использованных фрагментов ДНК были следующими: а) 5′- GCC GGC GGA ACT GGC CCA -3′ (домен BIR);
14
б) 5′-CGA CGT GGT GGC ACG GCG -3′ (домен RING). Таким образом, если антиапоптозные гены вируса гомологичны антиапоптозным генам хозяина, то применение таких фрагментов вирусных генов должно вызывать изменения в биохимических реакциях клеток непарного шелкопряда (например, механизмы, характерные для антисмысловых олигонуклеотидов). Последствием такого применения вирусного IAP-3 фрагмента гена может быть блокировка синтеза антиапоптозных белков, апоптоз пораженных фрагментами ДНК клеток и, как следствие, гибель насекомого. Таким образом, фрагменты вирусного гена IAP-3 могут иметь инсектицидное действие на гусениц непарного шелкопряда [5].
Через два-три дня в экспериментальной группе наблюдалась достоверная разница в смертности по сравнению с контрольной группой, где использовали обычную воду. Случайный одноцепочечный олигонуклеотид не вызвал достоверного различия в смертности по сравнению с контролем. В среднем за 11-суточный период в экспериментальных группах погибло 53 % особей, что на 30 % в среднем больше, чем в контрольных группах (χ2 = 23,72; d. f. = 1; P < 0,01) (табл. 1).
Таблица 1 Смертность гусениц I-II личиночных возрастов из экспериментальных и
контрольных групп трёх яйцекладок за 11-суточный период
|
Контрольная |
Экспериментальная |
Критерий χ2 |
|
группа |
группа |
|
|
|
|
|
Яйцекладка 1 |
10 % |
50 % |
11,43* |
|
|
|
|
Яйцекладка 2 |
10 % |
33 % |
5,03** |
|
|
|
|
Яйцекладка 3 |
50 % |
72 % |
3,55*** |
|
|
|
|
*P < 0,01; P** < 0,025; ***P < 0,1
Известно, что существуют белки, которые способствуют и препятствуют развитию апоптоза, и результат этого влияния очень часто зависит от их относительной концентрации [1]. Этот процесс может быть представлен в виде "весов" апоптоза-антиапоптоза. Различные факторы влияют на этот бинарный процесс, в результате чего "весы" отклоняются в ту или другую сторону. Это продолжается до определенной критической отметки, после которой сигнал к апоптозу или антиапоптозу (на некоторое время) становится неизменным. ДНК-фрагменты вируса смещают биохимические реакции клетки в сторону апоптоза, и основную роль в этом, вероятно, играет явление, похожее на РНКинтерференцию. При этом блокируется синтез антиапоптозных белков, что приводит к апоптозу отдельных клеток, а в определенных случаях – к гибели организма насекомого (рис. 9).
Используя формулу Хартли, подсчитаем количество информации, которое мы вносим в клетку насекомого при использовании двух фрагментов ДНК вируса длиной 18 нуклеотидов каждый: log2 418 + log2 418 = 2log2 418 = 4 log2 218 = 72 бита. Таким образом, внося в клетку 72 бита информации, мы приводим её к
15
гибели. Это столько же информации, сколько получается при нажатии 9 клавиш клавиатуры на компьютере (любой символ, за который отвечает определенная клавиша в компьютере, кодируется 8 битами или 1 байтом).
Рисунок 9. Схема действия фрагментов ДНК вируса на его хозяина: 1 – водный раствор одноцепочечных ДНК-фрагментов вируса; 2 – гусеница; 3-4 – клетки насекомого; а – одноцепочечные ДНК-фрагменты вируса; б – кутикула; в – цитоплазматическая мембрана; г – ядро клетки; д – процесс, сходный по механизму действия с РНК-интерференцией; е – «весы» апоптоза-антиапоптоза; ж – сигнал к антиапоптозу; с – сигнал к апоптозу; и – молекула клетки хозяина, с которой взаимодействует ДНК-фрагмент вируса для инициации гибели клетки
Нужно обратить внимание, что мы используем высокие концентрации фрагментов для достижения инсектицидного эффекта. Не меняя сигнала, мы увеличиваем его амплитуду. Это необходимо для того, чтобы фрагменты могли проникнуть в клетку и сигнал дошёл до «получателя». Можно сказать, что мы жмём на «9 клавиш» продолжительное время. Образно говоря, клетка «читает» утреннюю газету о своей гибели много раз подряд. Поэтому, например, при попадании четырёх фрагментов в клетку она прочитает её дважды: 2 раза по 72 бита (144 бита). Как известно, наличие развитой эпикутикулы в некоторой степени снижает проницаемость для большинства инсектицидов. Тем не менее, хлорорганические, фосфорорганические и другие контактные инсектициды могут пройти через эпикутикулу легко в организм насекомого через наиболее проницаемые части покровов насекомого, например дыхательную систему. Это связано с тем, что дыхательная система насекомого представлена дыхальцами, не защищёнными кутикулой и воском. Кроме этого, одноцепочечные молекулы ДНК имеют как гидрофильные (полярный сахаро-фосфатный остов) и гидрофобные (азотистые основания) части, которые, по-видимому, позволяют им проникать через полярные и неполярные барьеры тканей насекомого («подобное растворяется в подобном»). Стоит отметить, что структура одноцепочечной ДНК является достаточно гибкой, так как имеется свободное
16
вращение вокруг фосфодиэфирной связи, которая связывает соседние нуклеотиды. Эта особенность позволяет одноцепочечной ДНК принимать различные конформации, чтобы проникнуть более эффективно через части мембраны с различной морфологией.
ДНК-инсектициды – достаточно простой и наглядный способ того, как можно управлять жизнью клетки, используя универсальный язык всего живого
– нуклеиновые кислоты. При этом сами ДНК-инсектициды во многом ещё является «чёрным ящиком» и на многие вопросы ещё предстоит получить ответы.
МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ
Чтобы прочитать генетическую информацию, используют, как правило, два основных метода: полимеразную цепную реакцию и ДНК-секвенирование. Полимеразная цепная реакция используется для клонирования интересующего исследователя участка ДНК, а ДНК-секвенирование – для считывания последовательности клонированного участка.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Полимеразная цепная реакция является методом быстрого "клонирования" определенной части ДНК в пробирке в течение 30-40 циклов [4].
Полимеразная цепная реакция была изобретена американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году. Широкий уровень возможностей, дешевизна и простота ПЦР позволили этому методу найти применение в различных областях генетических исследований. В основе ПЦР лежит естественный процесс клеточной репликации.
Каждый цикл состоит из трех этапов: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (рис. 10). Для каждого шага существует определённый температурный и временной интервал:
1)денатурация (94 °С; 0,5 – 1 мин);
2)отжиг праймеров (35 – 65 °С; 0,5 – 1 мин);
3)синтез (72 oС; 0,5 – 1 мин).
Аккуратное выделение ДНК, амплификация ДНК, и детекция продуктов амплификации (электрофорез) обеспечивают высокое качество полимеразной цепной реакции. Количество ампликонов фрагмента ДНК из одной клетки, образованных во время ПЦР, может быть найдено по следующей формуле:
F = 2n – 2n, где n – число циклов.
При помощи правильно подобранных праймеров можно обнаружить мутации в исследуемом организме. Праймеры (короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, затравки) подбираются на основе баз данных, таких как GenBank, ICTVdb и т.д.
17
Рисунок 10. Схема ПЦР: I, II, III, – 1- 2-ой и 3-ий циклы; 0 – фрагмент целевой ДНК; a – денатурация; b – отжиг праймеров; c – синтез цепи; d – ампликоны
Использование ПЦР-метода обычно происходит в следующих двух типах ситуаций.
1. Используется специфические праймеры, которые будут отжигаться на определенном участке ДНК, заранее известном исследователю. То есть, известны места отжига праймера и расстояния между сайтами отжига праймеров. Это может быть определенный ген, теломеры хромосом, палиндромы и т. д. Для того, чтобы знать последовательность определенного участка ДНК, нужно прежде провести секвенирование данного фрагмента. Когда последовательность установлена и подобран праймер, можно проводить ПЦР.
Специфические праймеры используется, например, в диагностике инфекционных заболеваний. Для этого подбирается (например, в GenBank) и синтезируется праймер, который будет отжигаться только на ДНК определенного возбудителя заболевания.
2. Используется праймер (праймеры), который будет отжигаться случайно на ДНК. Такая разновидность ПЦР называется RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA, случайно амплифицированная ДНК). Часто используется для изучения генетического полиморфизма в популяциях. При этом невозможно
18
предсказать точно ни длину наработанных фрагментов, ни их число. Кроме этого, всегда существует вероятность, что используемый праймер не сработает. Поэтому перед началом исследований подбирают подходящий праймер.
Для примера смоделируем исследовательскую ситуацию. Например, существует организм А, на который действует фактор B (биотический или абиотический). Если произведено секвенирование генома организма А, найдены гены, отвечающие за взаимодействие с фактором B, подобраны праймеры к ним (генам), то лучше всего проводить исследование типа 1. Если отсутствует информация о геноме организма А (или ее очень мало), то проводиться исследование типа 2.
Далее (после ПЦР), например, в случае проведения исследования второго типа, в зависимости от полученных фрагментов ДНК, ведется поиск маркеров взаимодействия между организмом А и фактором B. Например, может оказаться, что наличие маркера длиной Х усиливает влияние фактора В на организм А, а наличие маркера длиной Y, наоборот, уменьшает это влияние.
ДНК-СЕКВЕНИРОВАНИЕ
Метод определения порядка нуклеотидных оснований в ДНК-мишени. Этот метод был изобретен британским ученым Фридериком Сенгером в 1975 году. В качестве матрицы при ДНК-секвенировании используется одноцепочечная ДНК. Для инициации секвенирования ДНК используются синтетические праймеры или природные субфрагменты, полученные при помощи рестриктаз. 3'-конец праймера должен заканчиваться перед участком ДНК, который будет секвенироваться [4].
Для выяснения последовательности нуклеотидов в целевой части ДНК, проводят 4 полимеразные реакции. В каждую из четырех смесей реакции обязательно нужно добавить дезоксинуклеозидтрифосфаты (дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ) и ДНК-полимеразу. Кроме этого, в каждую из пробирок добавляют один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддЦТФ, ддГТФ, ддТТФ и ддАТФ). ддНТФ в 3'-положении, вместо гидроксильной группы (ОН) содержит водород (Н). ddНТФ принимает участие в реакции полимеризации ДНК и сразу прекращает её. В каждой реакционной смеси соотношение между дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дАТФ и одним из ддНТФ составляет 100:1. Из-за низкой концентрации ддНТФ реакция не будет заканчиваться постоянно в начале секвенирования ДНК. В то же время реакционная смесь будет накапливать большое количество фрагментов ДНК различной длины (из-за присоединения ддНТФ в различных точках растущей нити ДНК) (рис. 11).
С помощью электрофореза продукты полимеризации ДНК разделяют и получают последовательность целевой ДНК. Секвенированная ДНК даёт информацию о последовательности нуклеотидов, а также о произошедших в фрагменте ДНК изменениях (мутациях).
19