3 курс / Фармакология / Диссертация_Яичков_И_И_Разработка_методик_количественного_определения

71

Рисунок 3.16. Хроматограмма, полученная после ввода раствора МФК в ацетонитриле в концентрации 5 мкг/мл

Таким образом, без использования дериватизации не удалось добиться формиро-

вания хроматографического пика МФК (рис. 3.16). Поэтому были получены триметил-

силил-производные (TMS-производные) данного соединения путём выпаривания 50 мкл его стандартного раствора с концентрацией 5 мкг/мл на вакуумном концентраторе

(60ºС; 3500 об/мин) с последующим добавлением 50 мкл смеси BSTFA и TMCS (99:1,

об./об.) и термостатирования при температуре 60ºС в течении 40 мин. Хроматографиро-

вание осуществлялось в перечисленных выше условиях.

Рисунок 3.17. Хроматограмма TMS-производного МФК

Рисунок 3.18. Масс-спектр TMS-производного МФК

72

При использовании триметилсилилирования был получен хроматографический пик деривата МФК (рис. 3.17). Значение m/z молекулярного иона составило 464, что свидетельствует об образовании ди-TMS-производного МФК (МФК-TMS) (рис. 3.18).

Наиболее интенсивным в спектре является ион со значением m/z 449, который образует-

ся в результате деметилирования метоксигруппы в бензольном кольце (рис. 3.19). По-

этому детектирование в режиме SIM будет производится путём регистрации данного иона.

Рисунок 3.19. Схема фрагментации ди-TMS-производного МФК при ионизации элек-

тронами При выборе температурной программы температура испарителя составила 275 С,

объём вводимой пробы – 1 мкл; режим ввода пробы – без деления потока; скорость по-

тока ПФ - 1 мл/мин; режим детектирования SIM - 449 m/z. Начальная температура тер-

мостата также поддерживалась 100 ºС в течение 3 мин. Уменьшение скорости подъёма температуры до 12,5 ºС/мин приводило к увеличению времени удерживания (tR) с 14,029

мин до 20,475 мин (рис. 3.20), а уменьшение конечной температуры до 250 ºС – ещё к большему увеличению tR до 27,095 мин, а также к значительной потере чувствительно-

сти в 10 раз (рис. 3.21). Таким образом, первоначальная температурная программа явля-

ется наиболее предпочтительной.

73

Рисунок 3.20. Хроматограмма TMS-производного МФК при скорости подъёма темпера-

туры 12,5 ºС/мин и конечной температуре 300 ºС

Рисунок 3.21. Хроматограмма TMS-производного МФК при скорости подъёма темпера-

туры 25 ºС/мин и конечной температуре 250 ºС

В результате подбора температуры испарителя и режима ввода пробы установле-

но, что наиболее высокая чувствительность достигается при 300 ºС и импульсном вводе пробы без деления потока. Время дериватизации в термостате при 60 ºС в течение 20

мин является достаточным, т.к. увеличение продолжительности реакции триметилсили-

лирования не приводило к повышению площади хроматографического пика МФК-TMS (табл. 3.13).

Таблица 3.13

Оптимизация времени дериватизации микофеноловой кислоты

75

Как видно из данных, приведённых в прил. 3 и рис. 3.22, наибольшая степень из-

влечения (СИ) достигается при использовании метиленхлорида при рН 2,0. Резкое уменьшение СИ при смещении рН среды в щелочную сторону связано с переводом мо-

лекулы МФК, которая является органической кислотой, в ионизированную форму, что препятствует её переходу в органическую фазу.

Для выбора оптимального времени экстракции к 1 мл фосфатного буферного раствора (БР) с рН 2,0 добавляли 50 мкл раствора МФК в концентрации 100 мкг/мл в ацетонитриле (концентрация раствора МФК - 5 мкг/мл), далее добавляли 1 мл органиче-

ского растворителя метиленхлорида. Полученная смесь перемешивалась на вортексе в течение 30 сек, 1 мин, 2 мин, 5 мин. Дальнейшая пробоподготовка осуществлялась ана-

логичным образом. Полученные результаты представлены в табл. 3.14.

Таблица 3.14

Влияние времени экстракции на степень извлечения МФК

Как видно из данных, приведённых в табл. 3.14, увеличение времени экстракции практически не влияет на СИ. Поэтому перемешивание смеси на вортексе в течение 30

сек является достаточным для максимального извлечения аналита.

3.1.3.2. Подбор условий экстракции микофеноловой кислоты из плазмы

Выбор оптимальных условий для извлечения МФК из плазмы крови производил-

ся на образце с концентрацией аналита 0,05 мкг/мл (НПКО). Для этого к плазме добав-

лялся фосфатный буферный раствор с рН=1,8 (для доведения рН до 2,0) в соотношении

2:1 (плазма/буферный раствор) и определённое количество МХ (табл. 3.15). Получен-

ную смесь перемешивалась на вортексе в течение 30 сек, а затем подвергалась центри-

фугированию при 3500 об/мин в течение 10 мин. Затем слой органического растворите-

ля отделялся и выпаривался в стеклянных виалах объёмом 2 мл на вакуумном концен-

траторе при 45ºС и 3500 об/мин в течение 15 мин. Сухой остаток реконструировался 50

мкл смеси BSTFA и TMCS (99:1) и дериватизировали в термостате. После этого 1 мкл

76

данного раствора вводился в хроматографическую систему и анализировался в указан-

ных выше условиях.

Как видно из данных, приведённых в табл. 3.15 и рис. 3.23, даже при экстракции из 0,25 мл плазмы 1 мл хлористого метилена удалось достичь достаточной площади хроматографического пика аналита. Данные условия выбраны для дальнейшего иссле-

дования, так как они позволяют минимизировать объём плазмы, необходимой для про-

ведения анализа образцов, полученных от добровольцев, а также приготовления калиб-

ровочных образцов и образцов контроля качества. Кроме того, при изолировании МФК из больших объёмов плазмы концентрация его TMS-производного в экстракте будет значительно выше, что может привести к значительному переносу определяемого веще-

ства из предыдущей пробы.

Рисунок 3.23. Пример хроматограммы ди-TMS-МФК после экстракции из 0,25 мл об-

разца плазмы с концентрацией аналита на уровне 0,05 мкг/мл Таким образом, для проведения пробоподготовки при количественном определе-

нии МФК в плазме методом ГХ/МС были выбраны следующие условия: к 250 мкл плаз-

мы добавлялось 125 мкл фосфатного буферного раствора рН = 1,8 и 1 мл дихлорметана,

полученная смесь перемешивалась на вортексе в течение 30 сек, а затем центрифугиро-

валась при 3500 об/мин. Слой органического растворителя отделяли и переносли в стек-

77

лянные виалы объёмом 2 мл. Экстракт выпаривался на вакуумном концентраторе при

45ºС и 3500 об/мин в течение 15 мин. К сухому остатку добавлялось 50 мкл смеси

BSTFA и TMCS (99:1, об./об.). Дериватизация проводилась в термостате при 60 ºС в те-

чение 20 мин. После этого 1 мкл данного раствора вводили в хроматографическую си-

стему [108].

3.1.3.3. Валидация ГХ-МС-методики определения микофеноловой кислоты в плазме

Аналитический диапазон ГХ-МС-методики определения МФК составил 0,05 - 30,0 мкг/мл. Концентрации калибровочных образцов и образцов контроля качества ис-

пользовались такие же, как и при валидации ВЭЖХ-МС-методики. Результаты валида-

ции методики представлены в табл. 3.16 [108].

В

Рисунок 3.24. Примеры хроматограмм холостого образца плазмы (А) и образца с кон-

центрацией МФК 0,05 мкг/мл (Б) и 30,00 мкг/мл (В)

79

В рамках валидации данной методики также изучалась стабильность TMS-

производного МФК при хранении в течение 48 ч в автосемплере (табл. 3.17). Получен-

ные результаты отвечали установленным требованиям.

Таблица 3.17

Результаты оценки стабильности ди-TMS-производного МФК при хранении в автосем-

плере

Таким образом, была впервые разработана и валидирована методика определения МФК в плазме крови методом ГХ-МС. Применение жидкостно-жидкостной экстракции для пробоподготовки, а также дериватизации аналита путём триметилсилилирования позволило достичь сопоставимого с ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС уровня чувствитель-

ности: нижний предел количественного определения МФК составил 0,05 мкг/мл.

3.1.4. Перекрёстная валидация разработанных методик определения микофеноло-

вой кислоты в плазме крови

При проведении перекрёстной валидации в качестве референтной методики была выбрана ВЭЖХ-МС/МС–методика, т.к. в данном случае для расчёта концентраций МФК применяется изотопно-меченный внутренний стандарт МФК-D3. По данным мно-

гочисленных публикаций, а также нормативной документации, данный способ расчёта является наиболее предпочтительным [22, 26, 40, 85, 87, 152].

80

А

Б

В

Рисунок 3.26. Пример SIMхроматограммы (А), TIC-хроматограммы (Б) и масс-спектра

(В) ди-TMS-производного МФК, полученные после анализа образцов плазмы крыс