3 курс / Фармакология / Диссертация_Поздняков_Д_И_Эндотелиопротекторная_активность_производных

При применении мексидола содержание С-реактивного (табл.12) белка у крыс снизилось по отношению к НК группе животных на 65,5% (p<0,05),

при полном восстановлении лейкоцитарной концентрации (табл.12)

(статистически значимых отличий относительно Л/О группы крыс установлено не было).

На фоне введения тиоктовой кислоты концентрация СРБ (табл.12)

статистически значимо не отличалась от таковой у НК группы крыс.

Содержание лейкоцитов (табл.12) в крови у крыс, получавших тиоктовую кислоту, было сопоставимо с группой Л/О животных.

У крыс, получавших сулодексид и ATACL, концентрация С-

реактивного белка (табл.12) относительно НК группы животных снизилась на 86,3% (p<0,05) и 99,1% (p<0,05) соответственно. При этом у данных групп животных наблюдалось полное восстановление лейкоцитарной концентрации

(содержание лейкоцитов (табл.12) уменьшилось по отношению к НК группе крыс на 52% (p<0,05) и 61,3% (p<0,05) соответственно).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенной оценки противовоспалительной функции эндотелия сосудов установлено, что в условиях ишемии головного мозга у крыс на фоне умеренного лейкоцитоза повышается концентрация СРБ в 6,2

(p<0,05) раза. Применение мексидола, сулодексида и ATACL способствовало устранению возникшего дисбаланса противовоспалительной функции эндотелия сосудов (применение препаратов нормализовало концентрацию лейкоцитов и способствовало снижению концентрации СРБ на 65,5% (p<0,05), 86,3% (p<0,05) и 99,1% (p<0,05) соответственно), в то время как введение тиоктовой кислоты значимого влияния на состояние антивоспалительного потенциала эндотелия сосудов не оказало.

91

ГЛАВА 8. Оценка потенциальных механизмов реализации эндотелиопротекторного действия 4-гидрокси-3,5-ди-трет-

бутилкоричной кислоты

8.1.Изучение влияния 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты на процессы генерации свободных радикалов и состояние про/антиоксидантного равновесия в условиях фокальной церебральной ишемии у крыс

Данная серия экспериментов выполнена в 2 этапа. На первом этапе производили оценку антирадикальных свойств соединения ATACL in vitro.

При этом определяли процент торможения образования супероксидного анион – радикала и нитрозильного радикала. Также по литературным данным некоторые производные коричной кислоты проявляют хелатирующие свойства в отношении тяжелых металлов [160], поэтому нами была исследована Fe2+-хелатирующая активность соединения ATACL. На втором этапе исследования проводили оценку влияния соединения ATACL на состояние про/антиоксидантного равновесия на фоне фокальной ишемии головного мозга у крыс (определяли концентрацию малонового диальдегида

идиеновых конъюгатов, а также активность каталазы, супероксиддисмутазы

иглутатионпероксидазы).

8.1.1.Изучение антирадикальной и Fe2+-хелатирующей активности 4-

гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты на моделях in vitro

Вданном блоке исследований осуществляли оценку антирадикальных

ихелатирующих свойств соединения ATACL в сравнении с мексидолом и тиоктовой кислотой.

Врезультате проведенного эксперимента установлено, что мексидол тормозит генерацию супероксидного анион-радикала на 56,3%, в то время как тиоктовая кислота снижает образование данного радикала всего на 24,9% (рис.18). Также выявлены антиNO – радикальные и хелатирующие свойства

92

мексидола, подтверждаемые торможением образования NO* на 42,4% и

комплекса с двухвалентным железом на 25,6%. Тиоктовая кислота проявила сходные с мексидолом свойства, однако процент торможения генерации NO*

и комплекса с Fe2+ был существенно ниже по сравнению с мексидолом

(рис.18).

Рисунок 18. Антирадикальные и хелатирующие свойства соединения

ATACL в сравнении с мексидолом и тиоктовой кислотой.

Обозначение: * - статистически значимо (t – критерий Стьюдента) относительно группы животных, получавших тиоктовую кислоту (p<0,05).

Соединение ATACL проявило сходную с мексидолом антирадикальную и хелатирующую активность (статистически значимых отличий не установлено). При сравнении антирадикальных свойств ATACL и

тиоктовой кислоты установлено, что процент торможение образования О2−* и

NO* у соединения ATACL был выше, чем у тикотовой кислоты на 93,6% (p<0,05) и 120,4% (p<0,05) соответственно, а процент терминации образования комплекса с двухвалентным железом (рис.18) на 100,9%

(p<0,05).Таким образом, соединение ATACL по антирадикальной и хелатирующей активности не уступает мексидолу и превосходит тиоктовую кислоту.

93

8.1.2.Изучение влияния 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты

состояние про/антиоксидантного равновесия в условиях фокальной

церебральной ишемии у крыс

Окислительный стресс является одним из основных звеньев патогенеза ишемического инсульта. При этом гиперпродукция свободных радикалов ведет к усугублению повреждения структур клетки [Луцкий М.А. с соавт., 2014]. Основная защитная функция от свободно-радикального окисления ложится на ферменты эндогенной антиоксидантной защиты:

супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу. Поэтому повышение активности указанных ферментов способно снизить гиперпродукцию свободных радикалов и нивелировать их повреждающее действие на мозговую ткань [Маслюкова А.В. с соавт., 2015].

В результате исследования установлено, что у крыс фокальная ишемия головного мозга приводит к развитию про/антиоксидантного дисбаланса,

сопровождаемого повышенным образованием оксидантов, что подтверждается увеличением концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов (рис.19) у группы крыс НК, по сравнению с Л/О

животными на 145,7% (p<0,01) и 178,8% (p<0,05) соответственно. Кроме того у НК группы животных активность ферментов эндогенной антиоксидантной защиты на фоне ишемии головного мозга была существенно ниже, чем у Л/О

крыс. Так у группы животных НК наблюдалось снижение (по сравнению с Л/О группой крыс) (рис.20, рис.21) активности: СОД – в 20,3 раза (p<0,05),

каталазы – в 7 раз (p<0,05), глутатионпероксидазы - в 6,4 раза (p<0,05)

94

Рисунок 19. Влияние 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты и препаратов сравнения на концентрацию малонового диальдегида и диеновых конъюгатов в гомогенате головного мозга крыс на фоне фокальной ишемии.

Обозначение: статистически значимо (U-критерий Манна-Уитни) относительно Л/О группы крыс * - p<0,01; # - p<0,05;

статистически значимо (U-критерий Манна-Уитни) относительно НК группы животных ∆ - p<0,02; α - p<0,05.

Применение мексидола на фоне ишемии головного мозга способствовало снижению концентрации МДА и ДК (рис.19), относительно группы животных НК на 70,1% (p<0,02) и 69,3% (p<0,02) соответственно.

Кроме того, у крыс на фоне введения мексидола наблюдалось повышение, по сравнению с НК группой крыс, активности СОД в 19,4 раза (p<0,02),

каталазы - на 245,5% (p<0,05), ГП – на 292,8% (p<0,02) (рис.20, рис.21). Как следствие повышения активности ферментов эндогенной антиоксидантной защиты и снижения образования прооксидантов, на фоне применения мексидола коэффициент окислительного стресса, по отношению к НК группе крыс уменьшился в 6,6 раз (p<0,05).

95

Рисунок 20. Влияние 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты и препаратов сравнения на активность супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в условиях фокальной церебральной ишемии у крыс.

Обозначение: # - статистически значимо (U-критерий Манна-Уитни) относительно Л/О группы крыс (p<0,05);

статистически значимо (U-критерий Манна-Уитни) относительно НК группы животных∆ - p<0,02;* - p<0,05.

У крыс на фоне применения тиоктовой кислоты концентрация МДА

(рис.19) на 41,4% (p<0,05) была ниже относительно НК группы животных.

Также введение тиоктовой кислоты способствовало повышению активности

каталазы и ГП (рис.20, рис.21) на 90,9% (p<0,05) и 127,3% (p<0,05)

соответственно. Остальные изучаемые показатели статистически значимо не

отличались от НК группы животных.

96

Рисунок 21. Влияние 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты и препаратов сравнения на активность каталазы в условиях фокальной церебральной ишемии у крыс.

Обозначение: # - статистически значимо относительно Л/О группы крыс (U- критерий Манна-Уитни, p<0,05);

статистически значимо (U-критерий Манна-Уитни) относительно НК группы животных∆ - p<0,02;* - p<0,05.

Применение соединения ATACL способствовало устранению про/антиоксидантного дисбаланса, возникшего в результате ишемического повреждения головного мозга, что подтверждается снижением концентрации прооксидантов МДА и ДК по сравнению с НК группой животных на 52,6% (p<0,05) и на 88,5%(p<0,05) соответственно (рис.19). Также на фоне введения данного соединения отмечено увеличение (по отношению к НК группе крыс)

активности ферментов антиоксидантной защиты, а именно активность СОД возросла в 18 раз (p<0,05), каталазы на 1456% (p<0,02) и

глутатионпероксидазы в 4,1 раза (p<0,05).

97

8.2.Изучение 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилкоричной кислоты на концентрацию изоферментов NO-синтазной системы и специфических маркеров эндотелиальной дисфункции в условиях фокальной

церебральной ишемии у крыс

У Л/О животных концентрация изоферментов синтазы оксида азота

(eNOS, nNOS, iNOS) составляла 77,9±0,009 пг/мл, 13±0,008 нг/мл и

16,7±0,013нг/мл соответственно (табл.13). При этом концентрация ассиметричного диметиларгинина у Л/О животных принимала значение

34,9±0,029 нг/мл. Концентрация РКС и матриксной металлопротеиназы-1у

Л/О крыс были 49,08±9,794 нг/мл и 24,17±1,297 нг/мл соответственно.

На фоне фокальной ишемии головного мозга у крыс отмечено повышение концентрации ADMA по сравнению с Л/О животными на 96%

(p<0,05). При этом повышение содержания ADMA у группы животных НК коррелировало с угнетением эндотелиальной NO-синтазы (концентрация eNOS у НК группы крыс уменьшилась относительно Л/О группы животных на 65,4% (p<0,05)), и повышением концентрации nNOS и iNOS на 63,5% (p<0,05) и 30,8% (p<0,05) соответственно. Кроме того у крыс НК отмечено повышение концентрации PKC и MMP1 (табл.16) по отношению к Л/О

группе животных на 179,5% (p<0,05) и 45,1% (p<0,05) соответственно.

При применении мексидола у крыс, по сравнению с группой животных НК наблюдалось снижение концентрации ADMA на 40% (p<0,05), nNOS и iNOS (на 14,7% и 39,3% (p<0,05) соответственно), и незначительном повышении концентрации eNOS – на 13,8%. Также у животных, получавших мексидол, отмечено снижение концентрации PKC на 109,5% (p<0,05).

Содержание MMP1 на фоне применения мексидола статистически значимо не отличалась от аналогичного значения группы крыс НК (табл.13).

У крыс, получавших тиоктовую кислоту, концентрация ADMA была ниже, чем у НК группы крыс на 41,6% (p<0,05). При этом концентрация

98

nNOS и iNOS у крыс, на фоне введения тиоктовой кислоты уменьшилась

(относительно НК группы крыс) на 48,3% (p<0,05) и 26,9% (p<0,05)

соответственно, а содержание eNOS, напротив, повысилось на 21,6%. Также у крыс, которым вводили тиоктовую кислоту, концентрация PKC, снизилась по отношению к группе животных НК на 83,8% (p<0,05). Следует отметить,

что введение крысам тиоктовой кислоты не вызвало статистически значимых, по сравнению с животными НК, изменений концентрации MMP1

(табл.13).

Таблица 13

Влияние соединения ATACL на концентрацию изоферментов NO-

синтазной системы и специфических маркеров эндотелиальной дисфункции на фоне фокальной ишемии головного мозга у крыс

Примечание: # - статистически значимо относительно Л/О группы животных (U – критерий Манна – Уитни, p<0,05);

*- статистически значимо относительно НК группы животных (U – критерий Манна – Уитни, p<0,05).

На фоне введения сулодексида (табл.13) у крыс по сравнению с животными НК группы отмечено снижение концентрации ADMA на 53,1%

(p<0,05). Кроме того у крыс, получавших сулодексид, наблюдалось повышение концентрации eNOS относительно группы животных НК на

28,9% (p<0,05), сопровождаемое понижением содержания nNOS и iNOS на

99

127,5% (p<0,05) и 68,3% (p<0,05) соответственно. Также на фоне введения сулодексида у крыс, по отношению к животным НК группы, наблюдалось уменьшение концентрации PKC и MMP1 на 139,3% (p<0,05) и 42,1% (p<0,05)

соответственно.

У животных, получавших соединение ATACL, концентрация ADMA

(табл.13) снизилась по отношению к НК группе крыс на 83,9% (p<0,05).

Снижение концентрации ADMA сопровождалось повышением содержания eNOS у животных, которым вводили ATACL, (относительно группы крыс НК) на 114,2% (p<0,05), концентрация nNOS и iNOS, у данной группы животных, напротив, уменьшилась на 60,6% (p<0,05) и 61,9% (p<0,05)

соответственно. Концентрация PKC у крыс на фоне введения ATACL

снизилась по отношению к НК группе животных на 108,6% (p<0,05). Также при применении ATACL наблюдалось снижение, относительно НК группы крыс, концентрации MMP1 на 37,7% (p<0,05).

8.3.Оценка церебропротекторной активности 4-гидрокси-3,5-ди-трет-

бутилкоричной кислоты в условиях фокальной церебральной ишемии у

крыс

В ходе постановки данного исследования было проведено 3 серии экспериментов: 1-я была направлена на изучение влияния соединения

ATACL на процессы потребления глюкозы и образования лактата,

концентрации митохондриальной АТФ-синтетазы и цитохром С оксидазы в ткани головного мозга на фоне фокальной ишемии; 2- я на оценку влияния соединения ATACL на степень гидратации мозговой ткани на фоне фокальной ишемии головного мозга; 3-я на изучение влияния соединения

ATACL на размер зоны некроза мозговой ткани на фоне фокальной ишемии головного мозга у крыс.

100