6 курс / Судебная медицина / Судебно_медицинская_экспертиза_отравлений_антихолинэстеразными_веществами
.pdfиспользованием специфических ингибиторов холинэстеразы дают полное право считать, что метод Келле явля ется строго специфичным способом определения локали зации холинэстеразы.
Для гистохимического исследования активности холин
эстеразы |
мы |
пользовались |
методом |
Келле — Фриден- |
вальда (1949) |
в модификации В. В. Португалова и |
|||
В.А.Яковлева |
(1951, 1953). |
|
|
|
Приводим подробное изложение этого метода в том |
||||
варианте, |
в котором мы его применяли (Я. С. Смусин, |
|||
1955). |
|
|
|
|
Приготовление растворов |
производится следующим |
|||
образом. |
|
|
|
|
Р а с т в о р А: 3,75 г гликокола; 18 мл |
нормального раствора |
|||
едкого калия; 82 мл дистиллированной воды. |
|
Ра с т в о р Б: 2,5 г кристаллический сернокислой меди; 100 мл дистиллированной воды.
Ра с т в о р В: 7,5 мг ацетилтиохолиниодида; 0,4 мл дистиллиро ванной воды; 0,1 мл раствора Б.
Образующийся при этом осадок йодистой меди отделяется при центрифугировании.
П р о п и с и и н к у б а ц и о н н о й с м е с и с а ц е т и л т и о - х о л и н и о д и д о м :
0,2 мл раствора А;
0,1 мл раствора Б;
4,3 мл дистиллированной воды.
Смесь выдерживается несколько минут в термостате при темпе ратуре 37°, прибавляется фильтрат раствора В и затем фильтруется.
П р о п и с и и н к у б а ц и о н н о й с м е с и с б у т и р и л т и о - х о л и н б р о м и д о м :
6 мг бутирилтиохолинбромида;
0,2 мл раствора А;
0,1 мл раствора Б;
4,7 мл дистиллированной воды. Раствор подвергается фильтрованию.
Растворы ацетилтиохолиниодида, бутирилтиохолинбромида и раствор В готовятся перед их употреблением на бидистиллированной воде.
Мышей забивали декапитацией. Вырезали кусочки исследуемой ткани небольших размеров (до 1 X 1 см при толщине до 0,5 см) и тотчас же на замораживающем ми кротоме приготовляли срезы толщиной до 40—60 \i (для мышечной ткани) или до 10—20 ц. (для головного моз га). Б. Ромейс (1953), справедливо отмечая, что обыч ным замораживающим микротомом получить хорошие срезы из свежих нефиксированных препаратов удается
4 Я. С. Смусин |
49 |
|
лишь с трудом, рекомендует употреблять нож глубокого охлаждения. Мы достигали глубокого охлаждения ножа, насаживая на него охлаждающую коробку с сухим льдом. Можно пользоваться микротомом на полупро водниках.
Срезы с ножа непосредственно переносятся в инку бационную смесь с ацетилтиохолиниодидом (для опреде ления истинной холинэстеразы) или в инкубационную смесь с бутирилтиохолинбромидом (для определения ложной холинэстеразы). Контрольные срезы перед погру жением в растворы субстратов предварительно помеща ют на 30 минут в раствор прозерина (1-10~3), что приводит к полной инактивации фермента, так как прозерин является сильнейшим ингибитором холин эстеразы.
Далее срезы помещают в термостат при температуре 37° для инкубации холинэстеразы. Время инкубации оп ределяется в зависимости от степени активности фермен та (мы варьировали от 20 минут до 2—3 часов). В тех случаях, когда необходимо было провести сравнительную оценку степени активности фермента, период инкубации был строго одинаков. Практически можно проводить ин кубацию в течение 1 часа — время, достаточное для хо рошего выявления фермента.
После инкубации срезы хорошо ополаскивают в 2— 3 порциях бидистиллированной воды (для освобождения их от остатков субстрата) и наклеивают на предметные стекла, после чего обрабатывают 10% раствором серни стого натрия в течение 1 минуты. Далее срезы тщательно промывают в нескольких порциях бидистиллированной воды (для освобождения от раствора сернистого натрия во избежание артефакта), обезвоживают спиртами вос ходящей крепости (50°, 70°, 85°, 96°, абсолютный спирт и спирт-эфир), просветляют карбол-ксилолом и 3 пор циями ксилола и заключают в канадский бальзам.
Приготовленные по описанному методу препараты дают возможность наблюдать локализацию холинэстера зы лишь в поверхностных слоях ткани. Для увеличения проницаемости клеточных оболочек мы воспользовались способом, предложенным В. В. Португаловым и В. А. Яковлевым (1951, 1953): кусочки исследуемой тка ни предварительно выдерживают в ацетоне в течение 3—24 часов при температуре около —60° (в сосуде Дюа-
50
pa с сухим льдом), затем тщательно отмывают от аце тона. Далее приготовляют срезы, которые подвергают последующей обработке, как было описано выше.
Темно-коричневые участки соответствуют местам ло кализации истинной холинэстеразы, причем интенсив ность окраски пропорциональна активности фермента. При обработке бутирилтиохолинбромидом ткань окра шивается диффузно в бледно-желтый цвет. Это говорит о том, что ложная холинэстераза распределяется в тка нях также диффузно.
Бутирилтиохолинбромид выявляет локализацию толь ко ложной холинэстеразы. Поэтому, если он сплошь ок рашивает всю ткань в бледно-желтый цвет, не оставляя неокрашенных участков, соответствующих локализации истинной холинэстеразы, то из этого вытекает, что в ме стах локализации истинной холинэстеразы имеется и ложный фермент (Я- С. Смусин, 1957).
Локализация истинной холинэстеразы в поперечнопо лосатой мускулатуре соответствует распределению шванновских элементов, сопровождающих аксон в зоне орган ного синапса, т. е. в моторной бляшке (рис. 9). Сарко плазма мышечного волокна в участках, непосредственно прилегающих к моторной бляшке, имеет очень слабую окраску. Места же контакта нерва с мышцей уже при малом увеличении микроскопа легко обнаруживаются по интенсивной окраске (рис. 10, 11). Большое увеличе ние микроскопа (рис. 12) дает возможность выявить ряд деталей (в особенности в тех препаратах, где кусочки были предварительно обработаны ацетоном): видны да же нервные окончания, доходящие до мышечных воло кон (рис. 13). На поперечных срезах (рис. 14, 15) мышеч ного волокна также видно, что вещество моторной бляш ки, плотно прилегая к мышечному волокну, оказывается отделенным от него тончайшей мембраной, что соответ ствует данным В. В. Португалова (1955) и данным уль траструктурных электронномикроскопических исследова ний (Э. М. Плисецкая, 1961).
Помимо моторных бляшек, истинная холинэстераза содержится также в ядрах мышечных волокон. Предва рительная обработка срезов прозерином полностью угне тает активность истинной холинэстеразы (рис. 16).
В мышечной ткани ложная холинэстераза распреде ляется диффузно.
4* |
51 |
|
В коре головного мозга наблюдается довольно ин-ген- сивное диффузное прокрашивание. Четко выделяются нервные клетки — они окрашены в желтовато-коричне вый цвет. Ганглиозные клетки в области аммонова рога обладают довольно высокой холинэстеразной активно стью.
В подкорковых образованиях хорошо выражена сло истость в области овального центра; глия в этих отделах также обладает высокой холинэстеразной активностью; клетки светло-коричневого цвета, с четкими границами. В области лучистой короны на фоне ярко-желтого диф фузного окрашивания ткани также видны довольно круп ные ганглиозные клетки и глия, обладающая высокой хо линэстеразной активностью. В области хвостатого ядра и в особенности его головки очень высока холинэстеразная активность нервных клеток (рис. 17). Зрительный бугор более бледно диффузно окрашен, и активность холинэстеразы клеток глии ниже остальных отделов под корковых узлов.
На разрезе на уровне заднего отдела стволовой части мозга и тела мозжечка видно диффузное окрашивание ткани, более ярко выраженное в области тела мозжечка. Нервные клетки центрального отдела стволовой части мозга обладают в умеренной степени холинэстеразной активностью. Четко видны моторные ядра в виде круп ных округлой формы образований с желтовато-коричне вым центром и светлым ободком по периферии. Они рас полагаются в нижне-латеральных отделах стволовой части мозга, что соответствует ядрам VII и VIII пары черепномозговых нервов, а также рубро-спинальному, или экстрапирамидному, пучку и заднему мозжечковому пуч ку бокового канатика.
При микроскопическом исследовании продолговатого мозга отмечается диффузное окрашивание ткани в жел товатый цвет, умеренно выраженная холинэстеразная активность ганглиозных клеток центральных и перифери ческих отделов. В области внутренне-наружных отделов передних рогов располагаются крупные моторные ядра округлой формы с темно-коричневым центром и светлым ободком (рис. 18).
Глава III
АКТИВНОСТЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗ В ЗДОРОВОМ ОРГАНИЗМЕ И ПРИ НЕКОТОРЫХ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЯХ
Для оценки степени угнетения веществами антихолинэстеразного действия активности холинэстеразы в той или иной ткани необходимо знать пределы колебаний активности холинэстеразы различных тканей у людей, умерших от других причин (не от отравлений антихолинэстеразными веществами), и проследить за снижением холинэстеразной активности по мере разложения трупа. Составление такого «атласа» холинэстеразной активно сти тканей трупов людей «в норме» является важной за дачей для судебной медицины.
УРОВЕНЬ ХОЛИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ
У людей как в норме, так и при некоторых патоло гических процессах наиболее детально изучена холинэстеразная активность крови.
Известно, что у каждого здорового человека актив ность холинэстеразы крови является величиной относи тельно постоянной, хотя у различных лиц наблюдаются широкие ее колебания (М. Я. Михельсон, 1948; Augustinsson, 1955; А. А. Покровский, 1960). Подробная сводка данных об определяемом при жизни уровне холинэсте разной активности цельной крови и плазмы людей, по лученных многочисленными авторами различными мето дами, приводится в обзорах Augustinsson (1955, 1963), Koelle (1963) и Grob (1963).
Augustinsson (1955) манометрическим методом с ис пользованием бутирилхолина (для плазмы) и ацетил-бе- та-метилхолина (для эритроцитов) установил, что актив ность холинэстеразы плазмы у мужчин больше, чем у женщин, и при повторных исследованиях она меняется в пределах ± 6 % . Что касается активности холинэстера-