5 курс / ОЗИЗО Общественное здоровье и здравоохранение / Инновационное_развитие_науки_фундаментальные_и_прикладные

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

POLYMORPHISM OF GENES OF ETHYLENE BIOSYNTHESIS MD-ACS1 AND MD-ACO1 IN APPLE VARIETIES OF DOMESTIC AND FOREIGN SELECTION OF AUTUMN FRUIT RIPENING PERIOD

Dulov Mikhail Ivanovich

Abstract: A decrease in the level of endogenous biosynthesis of ethylene during fruit ripening and suppression of its action contribute to a significant increase in the shelf life and quality of apples. The main genes responsible for the biosynthesis of ethylene in apple fruits during ripening and storage are the MdACS1 and Md-ACO1 genes. Md-ACS1 genes are the limiting factor in ethylene biosynthesis. Varieties homozygous for the Md-ACS1-2 allele are characterized by a reduced level, and heterozygous genotypes (ACS1-1/2) have an average level of ethylene biosynthesis. Homozygosity for the Md-ACO1-1 allele in combination with the Md-ACS1-2/2 allele variant leads to an additional decrease in ethylene synthesis in apple fruits and an increase in their shelf life. In apple varieties of the autumn ripening period of the Russian selection, the frequency of occurrence of the Md-ACS1-2 allele in homozygote averages 2,32%, in varieties of foreign selection

– 8,63%, in the heterozygous state – 13,95 and 35,25%, respectively. Apple varieties of the autumn ripening period of Russian and foreign breeding homozygous for the Md-ACS1-2 allele have low or medium winter hardiness. When creating genotypes of apple trees of a new generation of autumn ripening period for the conditions of the Volga region, it is of interest to use the varieties of domestic selection Uspenskoye, Zhigulevskoye, Pinkish winter and Zacherenkovoye as parental forms, and from the genotypes of foreign breeding varieties Syabryna and Reanda. These varieties are heterozygous for the alleles of the ACK synthase gene (Md-ACS1-1/2) and the ACK oxidase gene (Md-ACO1- 1/2) with an average level of ethylene biosynthesis in fruits and good preservation of their consumer properties during storage.

Key words: apple tree, variety, fruit storage, ethylene biosynthesis, MdACS1, Md-ACO1, polymorphism.

Важным компонентом здорового питания являются яблоки, которые позволяют предотвратить сердечно-сосудистые заболевания и преждевременное старение организма. Плоды яблони можно употреблять непосредственно в свежем виде, некоторые сорта хранить в течение нескольких месяцев и значительную часть использовать в качестве сырья при производстве здорового питания.

За последние годы в странах мира производство яблок составляет в среднем 85,07 млн. тонн, в том числе в странах Европы – 17,21 млн. тонн, Америки – 9,66 млн. тонн, Азии – 54,40 млн. тонн, Африки – 2,99 млн. тонн,

39

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

Океании – 0,81 млн. тонн. В России валовый сбор урожая плодов яблони остается практически на одном уровне и равняется в среднем 1,78 млн. тонн [1].

В зависимости от сорта и условий выращивания свежие плоды яблони содержат в среднем 12,5-16,0% сухих веществ, 11,5-14,5% углеводов, 2,0-3,0% клетчатки, 0,15-0,25% минеральных веществ, 0,6-1,1% пектиновых веществ и до 1,2% различных кислот [2]. Углеводы в яблоках в основном представлены моно- и дисахаридами, их количество изменяется от 8,4 до 11,5%. На долю глюкозы приходится 1,7-2,8%, фруктозы 5,6-6,5%, сахарозы 0,8-2,5%. Из макроэлементов в яблоках содержится калий (80-320 мг%), фосфор (9-23 мг%), кальций (3-16 мг%), кремний (2-5 мг%), магний (3-9 мг%), из микроэлементов - бор (210-240 мкг%), алюминий (80-110 мкг%), марганец (27-85 мкг%), медь (8-65 мкг%), цинк (35-140 мкг%) [3]. По содержанию биологически активных соединений яблоки уступают некоторым фруктам, однако, универсальность набора элементов, входящих в состав и возможность длительного хранения делают их незаменимыми.

В настоящее время яблоня домашняя (культурная) выращивается во всех умеренных и субтропических странах мира и насчитывает около 10,0 тыс. сортов [4], которые имеют разную скорость созревания плодов, способность сохранять внешний вид и товарно-потребительские показатели качества в течение определенного периода времени. Плоды некоторых сортов яблони необходимо помещать в камеру хранения сразу после сбора, так как они очень быстро теряют свои товарные качества, в то время как другие обладают хорошей лежкостью и без особых условий сохраняют потребительскую привлекательность плодов в течение длительного времени, в том числе после снятия с хранения и доставки их в торговые предприятия.

Продолжительность хранения яблок и снижение экономических потерь после уборки урожая во многом связано с изменением структуры мякоти плодов при созревании и хранении в результате различных физиологических и биохимических процессов, среди которых важная роль принадлежит процессу эндогенного синтеза этилена, увеличение интенсивности которого приводит к размягчению мякоти за счет активации различных ферментативных систем, влияющих на плотность клеточной стенки [5]. Чрезмерное размягчение мякоти яблок является нежелательным, поскольку приводит к необратимому процессу старения плодов, и, следовательно, к короткому сроку хранения и снижению вкусовых качеств. Снижение уровня выработки этилена в плодах и подавление его действия способствуют значительному повышению сроков хранения и качества яблок.

Этилен, газообразный фитогормон, играет центральную роль в созревании плодов. В процессе созревания яблок выработка этилена постепенно увеличивается до пика, а затем постепенно уменьшается и плод переходит в стадию старения [6]. Этилен, вырабатываемый в период

40

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

формирования плодов яблони, автоингибируется, а этилен, произведенный в период созревания, ускоряет сроки наступления климактерического периода и стадии старения плодов.

Биосинтез этилена в плодах различных сортов яблони варьирует в больших пределах, что в значительной степени влияет на их твердость и сохраняемость во время и после хранения. В биосинтезе этилена в плодах яблони основными ферментами являются 1-аминоциклопропан-1- карбоксилатсинтаза (АЦК-синтаза, АСС-синтаза, ACS) [ЕС 4.4.1.14] и 1- аминоциклопропан-1-карбоновая кислота оксидаза (АЦК-оксидаза, АССоксидаза, ACO) [ЕС 1.14.17.4]. На начальном этапе биосинтеза этилена фермент АЦК-синтаза преобразует S-аденозил-L-метионин (Адеметионин – аминокислота естественного происхождения, производная аминокислоты метионин) в 1-аминоциклопропан-1-карбоновую кислоту (АЦК, АСС), которая является промежуточным продуктом в биосинтезе растительного гормона этилена. Далее в присутствии кислорода АЦК под воздействием АЦК-оксидазы разлагается с образованием этилена, аммиака, муравьиной кислоты и CO2 [7]. Таким образом, биосинтез этилена в плодах яблони тесно связан с концентрацией АЦК (1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислота) и интенсивностью работы ферментов АЦК-синтаза и АЦК-оксидаза, которые ограничивают скорость производства этилена [6].

Интенсивность работы ферментов АЦК-синтаза и АЦК-оксидаза кодируется серией генов Md-ACS и Md-ACO, экспрессирующихся в разных тканях и на разных этапах созревания плодов [8, 9]. Лимитирующим фактором в биосинтезе этилена являются гены АЦК-синтаза семейства ACS. Важность Md-ACS1 в созревании плодов была показана на трансгенных яблоках, в которых Md-ACS1 был подавлен с помощью РНК-интерференции. При подавлении Md-ACS1 яблоки производило на 94% меньше этилена при дыхании и были значительно более прочным, чем в контроле, демонстрируя более длительный срок хранения [10].

В генотипе яблони среди генов семейства ACS наиболее важными генами, которые регулируют биосинтез этилена во время развития и созревания плодов, являются гены Md-ACS1, Md-ACS3a и Md-ACS6 [6, 11, 12]. Из них Md-ACS6 экспрессируется до экспрессии Md-ACS3a и MdACS1 [12], подразумевая, что Md-ACS6 в основном катализирует выработку этилена на предварительной стадии развития плодов яблони.

Экспрессия Md-ACS6 снижается примерно за 30 дней до созревания, когда инициируется экспрессия Md-ACS3a. На поздних стадиях созревания плодов яблони экспрессируется только Md-ACS1 [13].

Изучение экспрессии гена АЦК-оксидазы яблони и его роли в созревании плодов позволило идентифицировать следующие Md-ACO гены:

Md-ACO1, Md-ACO2, Md-ACO3 и Md-ACO4 [9, 14]. Сравнение нуклеотидных последовательностей Md-ACO генов показало, что последовательность ACO1

41

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

иACO2 идентичны на 93,3%, в то время как ACO1 и ACO3 идентичны на 78,5%, а ACO2 и ACO3 – на 77,8% [15]. Ген Md-ACOl экспрессируется в зрелых плодах, его продукт практически не встречается в молодых плодах и совсем не экспрессируется в листьях. Md-ACO2, Md-АСОЗ и Md-CO4 экспрессируются в тканях молодых и старых листьев, в то время как MdАСОЗ - больше в тканях молодых листьев, Md-ACO2 (обычно вместе с MdАСО1) - преимущественно в зрелых плодах.

Основными генами, ответственными за биосинтез этилена в плодах яблони во время созревания и при хранении, являются гены Md-ACS1 (LG 15)

иMd-ACO1 (LG 10), что существенно влияет на их сохраняемость как во время, так и после хранения [16]. В локусе Md-ACS1 идентифицированы две аллельные формы, Md-ACS1-1 и Md-ACS1-2, которые обуславливают различный уровень биосинтеза этилена в плодах при хранении. Аллель Md- ACS1-1 (489 п. н.) приводит к нормальному производству этилена, в то время как аллель Md-ACS1-2 (655 п. н.) связан со сниженным уровнем этилена, что обусловлено вставкой ретротранспозона в промотерной зоне [14, 17].

Гомозиготность по аллелю Md-ACS1-1 (ACS1-1/ACS1-1) указывает на максимальное продуцирование этилена в плодах, невысокую степень их лежкости и отсутствие данной гомозиготы в генотипе может служить первым критерием на селекцию сортов яблони с твердыми, длительно хранящимися плодами. Для плодов яблони, гомозиготных по аллелю Md-ACS1-2 (ACS1- 2/ACS1-2), характерен пониженный уровень, а у гетерозиготных генотипов (ACS1-1/ACS1-2) – средний уровень биосинтеза этилена [16].

Влокусе Md-ACO1 идентифицированы также две аллели: сорта, гомозиготные по аллелю 1 (ACO1-1/ACO1-1) с низким содержанием этилена, демонстрируют лучшее сохранение стойкости, чем гетерозиготные сорта

(ACO1-1/ACO1-2) и сорта, гомозиготные по аллелю 2 (ACO1-2/ACO1-2).

Аллелю Md-ACO1-1 соответствует фрагмент амплификации длиной 525 п. н., аллелю Md-ACO1-2 – длиной 587 п. н. [18]. Гомозиготность по аллелю Md- ACO1-1 в сочетании с аллельным вариантом Md-ACS1-2/2 по гену АЦКсинтазы приводит к дополнительному значительному снижению синтеза этилена в плодах яблони и увеличению срока их хранения [16, 19].

Для генов Md-ACS1 и Md-ACO1 созданы эффективные ДНК-маркеры, позволяющие идентифицировать их аллельные варианты. Их наличие дает возможность выполнять ДНК-маркерный скрининг генофонда для выявления генотипов, несущих наиболее ценные сочетания аллелей, а также проводить их идентификацию в селекционном материале для создания сортов, обладающих повышенной лежкостью плодов. Для идентификации аллелей гена Md-ACS1 используют маркер Md-ACS1 [20], гена Md-ACO1 – маркер Md-ACO1 [14], праймеры которых имеют следующую нуклеотидную последовательность:

42

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

Md-ACS1 For 5‘-AGAGAGATGCCATTTTTGTTCGTAC-3‘ Md-ACS1 Rev 5‘- CTACAAACTTGCGTGGGGATTATAAGTGT-3‘ Md-ACO1 For 5‘-TCCCCCCAATGCACCACTCCA-3‘

Md-ACO1 Rev 5‘-GATTCCTTGGCCTTCATAGCTTC-3‘

Реакционная смесь для ПЦР объемом 15 мкл содержит: 20 нг геномной ДНК, 1,5 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgSO4, 10 пM каждого праймера (прямой и обратный), 1 ед. Taq-полимеразы и 2,5 мМ 10х Taq-буфера (+(NH4)2SO4, - KCL). Амплификацию проводят в термоциклере T100 производства фирмы «BIO-RAD» (США). Параметры циклов амплификации: 2 минуты при 94°C; 35 циклов: 65ºC – 45 с, 72ºC – 2 мин, 94ºC – 45 с; 1 цикл: 650С – 45 с;

финальная элонгация 72ºC – 10 мин [14]. Разделение целевых продуктов маркеров осуществляется методом электрофореза в 2% агарозном геле. Для определения длины амплифицированных фрагментов используется маркер молекулярной массы Gene Ruler 100 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).

Целью данной работы является проведение анализа данных генетического полиморфизма наиболее известных и распространенных сортов яблони осеннего срока созревания российской и зарубежной селекции с выявленным состоянием генов Md-ACS1 и Md-ACO1, вовлеченных в биосинтез этилена в плодах, чтобы предоставить селекционерам и производителям яблок информацию о генотипах, несущих ценные комбинации аллелей и проявляющих способность к лучшей сохраняемости яблок во время хранения.

Объектом анализа аллельного состояния генов биосинтеза этилена в плодах яблони осеннего срока созревания служили 87 сортов отечественной селекции и 140 сортов селекции 22 зарубежных стран, из них Великобритания (17 сортов), США (16), Эстония (16), Швеция (14), Германия (11), Республика Беларусь (8), Литва (7), Япония (7), Финляндия (6), Канада (6), Кахастан (6), Украина (4), Латвия (3), Польша (3), Дания (3), Франция (3), Нидерланды (3), Новая Зеландия (2), Чехия (2), Сербия (1), Италия (1), Норвегия (1).

Данные аллельного разнообразия генов Md-ACS1 и Md-ACO1 сортов яблони российской селекции осеннего срока созревания приведены в таблице 1. Приведенные результаты исследований отечественных и зарубежных ученых свидетельствуют, что в яблоках российской селекции частота встречаемости аллеля Md-ACS1-2 в гомозиготном состоянии, что связано со значительно меньшим выделением этилена в период созревания плодов и способностью их дольше сохранять потребительские и вкусовые свойства, составляет в среднем 2,32%. В выборке из 86 сортов яблони отечественной селекции, с установленным состоянием АЦК-синтазы, гомозиготу Md-ACS1-2 имеет сорт Василиса, созданный в СКЗНИИСиВ совместно с ВНИИСПК от скрещивания сортов Прима и Уэлси тетраплоидный, а также сорт Зори Кубани, полученный в СКЗНИИСиВ от скрещивания сортов Уэлси × Кубань спур.

43

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

Таблица 1 Аллельное разнообразие генов Md-ACS1 и Md-ACO1 сортов яблони осеннего срока созревания отечественной селекции

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

Продолжение таблицы 1

45

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

Продолжение таблицы 1

Гетерозиготными генотипами (Md-ACS1-1/2), со средним уровнем синтеза этилена в плодах во время созревания и при хранении, являются в среднем 13,95% российских сортов яблони осеннего срока созревания. В анализируемой выборке сортов яблони гетерозиготными по данному признаку являются сорта Анисовка, Апорт кубанский, Бархатное, Березовка от Исакова, Жигулевское, Зачеренковое, Коричное новое, Малюха, Розовое зимнее, Скала, Талисман и Успенское.

Гомозиготность по аллелю Md-ACS1-1 (Md-ACS1-1/1) приводит к высокому уровню синтеза этилена в плодах яблони [21]. Из 86 анализируемых сортов российской селекции с известным аллельным состоянием гена АЦК-

46

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

синтазы наличие гомозиготы ACS1-1/1 обнаружено у 72 сортов, что составляет 83,72% от объема выборки. Гомозиготными по аллелю 1 гена MdACO1 являются сорта Анис бархатный, Анис Серый, Анис Шацкий, Антоновка Краснобочка, Антоновка монастырская, Антоновка шестисотграммовая, Апорт Александр, Ахлебина Позднее, Бархат осени, Бель Чернышевская, Бельфлер Китайка, Бельфлер красный, Бессемянка мичуринская, Большак, Боровинка, Боровинка Акуловская, Боровинка Иванцовская, Боровинка Могучая, Буховка, Варгуль, Викинг, Волошка, Восковое Степина, Грушовка Юдичева, Данила (ВЭМ желтый), Делюкинское, Дочь Коричного, Зарянка, Кальвиль Оранжевый, Кандиль Синап, Китайка Санинская, Коричное полосатое, Коричное Ананасное, Коричное Белое, Коробовка Новая, Королевское Краснознаменное, Лимонное, Лимоновка, Мамутовское, Московское ожерелье, Наливное янтарное, Орловский пионер, Осенний Квас, Останкино, Память Исаева, Пармен Северный, Первинка, Река, Родниковая, Розочка, Румянка свердловская, Северная зорька, Синап белый, Скрыжапель, Сливочное, Соковое 3, Солнышко, Таватуй, Таежное, Терентьевка, Титовка, Титовка клон, Тюшкинское Красное, Уралец, Уральское Наливное, Федоровское, Черногуз, Черное дерево, Шаропай, Экранное, Яблоня Добрыничева.

Отмечено, что в плодах яблони отечественной селекции осеннего срока созревания аллельная форма Md-ACS1-1 в гомозиготном состоянии (Md- ACS1-1/1), как правило, присутствует в генотипе стародавних сортов и у местных сортов яблони.

Мутация аллеля 1 (InDel в третьем интроне) гена Md-ACO1 (Md-ACO1- 1) усиливает действие аллеля Md-ACS1-2/2 и обусловливает дополнительное снижение уровня биосинтеза эндогенного этилена в плодах. Сорта яблони, с врожденным низким содержанием этилена в плодах (ACS1-2/2 + ACO1-1/1), не только обеспечивают лучшую сохраняемость, но также могут быть менее зависимы от условий после сбора урожая и обработки, ингибирующей этилен, для продления периода реализации. Таких сортов яблони отечественной селекции осеннего срока созревания в стране очень мало.

По данным И.И. Супрун, С.В. Токмакова, Е.А. Добренкова [23] аллель гена Md-ACO1-1 в гомозиготе имеется в яблоках сорта Апорт кубанский, которая в сочетании с гетерозиготным состоянием гена Md-ACS1 (Md-ACS1- 1/2) обуславливает пониженный уровень синтеза этилена и позволяет рекомендовать данный сорт в качестве донора ценного признака данного гена.

В настоящее время в ФГБНУ «Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия» в рамках реализации проекта на тему «Изучение биоразнообразия и формирование идентифицированных коллекций рода Malus Mill. для ускоренного создания сортов с долговременной устойчивостью к Venturia inaequalis (Cooke) G. Winter» [36] в генотипе яблони сорта Памяти Евдокимова обнаружено

47

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

ИННОВАЦИОННОЕ РАЗВИТИЕ НАУКИ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ ПРОБЛЕМЫ

гомозиготное состояние гена Md-ACO1 по аллелю Md-ACO1-1/1, что обуславливает высокую лежкость плодов данного сорта осеннего срока созревания. Сорт создан в СКФНЦСВВ совместно с ВНИИСПК от скрещивания сортов Голден Делишес тетраплоидный х (F2 M. floribunda х Голден Делишес тетраплоидный). Сорт имеет ген иммунитета к парше Vf, устойчив к мучнистой росе, морозо- и засухоустойчив, по внешнему виду и характеру вкуса имеет сходство с сортом Голден Делишес.

Результаты исследований ученых стран мира по изучению полиморфизма генов биосинтеза этилена у сортов яблони зарубежной селекции осеннего срока созревания приведены в таблице 2. Отмечено, что в яблоках осеннего срока созревания селекции зарубежных стран частота встречаемости аллеля Md-ACS1-2/2 примерно в 3,5-4,0 раза больше, чем в плодах сортов российской селекции, и в среднем составляет 8,63%.

В выборке из 139 сортов яблони зарубежной селекции, с установленным состоянием АЦК-синтазы, аллель Md-ACS1-2 в гомозиготе выявлена у сортов, созданных в Японии (Акане, Сеншу), Германии (Алкмен, Ребелла), США (Зестар, Опалесцирующий), Новой Зеландии (Гала, Гала Маст), Чехии (Райка), Сербии (Роял Гала), Канаде (Салиш), Италии (Чивни). Данные генотипы, обуславливающие в плодах низкий уровень биосинтеза этилена, необходимо в программах селекции яблони привлекать в качестве родительских форм при скрещивании при создании сортов с длительным сроком хранения.

Таблица 2 Аллельное разнообразие генов Md-ACS1 и Md-ACO1 сортов

яблони осеннего срока созревания селекции зарубежных стран

48

МЦНП «НОВАЯ НАУКА»

Рекомендовано к изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/