3 курс / Общая хирургия и оперативная хирургия / Мельцова_А_Ж_Использование_аллогенных_фибробластов_в_комплексном

31

применялись как метод восстановления кожного покрова у обожженных. Одной из основных задач комбустиологии является скорейшее восстановление кожного покрова у тяжелообожженных на больших площадях ожоговых ран. (Туманов В.П. и соавт., 1996; Жилина Н.М. и соавт., 1997). При этом трудноразрешимой задачей в лечении ожогов является недостаток донорских ресурсов, что препятствует улучшению лечения обожженных. Существующие до последнего времени биологические и синтетические материалы могли быть использованы только как временные покрытия ран на этапах аутодермопластики. В связи с этим получение клеток in vitro и их трансплантация на ожоговые поверхности ознаменовали новый подход к решению указанных проблем (Парамонов Б.А. и соавт., 2001).

В настоящее время биотехнологические методы восстановления кожного покрова включают в себя использование как аутоклеток культивированных in vitro, так и использование аллогенных клеточных культур. За рубежом в настоящее время широкое распространение получила методика выращивания и пересадки аутологичных кератиноцитов по методу Грина. Этот метод позволяет в короткие сроки выращивать эпителиальные пласты, в сотни и тысячи раз превышающие размер исходного кожного лоскута (Odessey R., 1992). Метод Грина позволяет решить проблему дефицита донорских ресурсов кожи. Опубликованы результаты успешного применения метода для восстановления кожного покрова у тяжелообожженных с площадью ожоговой поверхности от 70 до 92% (Patton M., 1990). Влияние временного фактора, не позволяющего вырастить необходимый объем эпителиальных пластов, заставляет ученых обратиться к применению аллогенных клеток, что создает возможность заготовки клеточного материала заранее. Опубликованы результаты успешного применения аллогенных КЦ для лечения ожоговых ран и донорских участков (Fanne M., 1987; Hammond E. et al., 1987). Несмотря на успехи и перспективность метода использования культур КЦ для лечения ран, существует ряд недостатков ограничивающих его практическое применение. Длительность выращивания пластов аутоклеток велика и составляет 3-4 недели,

32

что резко увеличивает риск осложнений и невозможность создания банка; сложность приживления на раневую поверхность и отторжение аллогенных КЦ; высокая стоимость затрат сложность условий культивации клеток эпидермиса. Все вышеизложенное явилось поводом для разработки нового направления использования биотехнологических методов для восстановления кожного покрова.

В нашей стране в начале 90-х годов прошлого века в отделении патологической анатомии и центре термических поражений Института хирургии им. А.В.Вишневского РАМН под руководством академика Д.С. Саркисова был разработан новый метод лечения ожоговых ран с использованием культивированных ФБ. Принципиальным отличием этого метода является то, что основным компонентом культивируемого пласта клеток являются аллогенные ФБ (Саркисов Д.С. и соавт., 1990, 1991; Федоров В.Д. и соавт., 1996; Туманов В.П. и соавт., 1998). Данная методика широко используется как в учереждении-разработчике, так и в различных медицинских центрах нашей страны. Применение этого метода обеспечивает стимуляцию процессов эпителизации ожоговых ран, что позволяет использовать их в лечении обожженных с поражением IIIа–IIIб степеней, а также при ограниченных ожогах IIIб–IVстепени (Глущенко Е.В. и соавт., 1993). В.П. Туманов и соавт. (1999), анализируя 10-летний опыт применения культивированных аллогенных ФБ для лечения термических ожогов, отмечают высокую эффективность этого метода лечения у 333 больных. Сочетание быстроты получения трансплантата (1-3 суток) с высоким процентом его приживления (96%), учитывая выраженный ранозаживляющий эффект, делает этот метод, по мнению авторов, одним из наиболее перспективных в комбустиологии (Туманов В.П. и соавт., 1999). Трансплантация культивированных аллогенных ФБ находит также своё применение для заживления донорских участков после забора кожи для аутодермопластики. Тяжелое состояние больных, инфицирование ран, снижение репаративной активности приводят к замедлению эпителизации донорских участков. В

33

результате применения аллотрансплантации ФБ сроки эпителизации существенно сокращались, даже у тяжелообожженных (Мороз В.Ю. и соавт., 1993; Гришкевич В.М. и соавт., 1998). Хорошие результаты получены при сочетании транплантации культур аллогенных ФБ и аутодермопластики ожоговых ран. Применение пересадок ФБ привело к ускорению эпителизации и изменению структуры неоэпителия (отмечалась более ранняя дифференциация слоев), по сравнению с изолированной аутодермопластикой (Жилина Н.М. и

соавт., 1997).

Анализируя работы зарубежных авторов, необходимо отметить, что в США и странах Западной Европы идея применения культивированных клеток нашла более широкое научное развитие и клиническое применение, чем в нашей стране. Помимо использования клеточных продуктов, для восстановления кожного покрова обожженных, описано их применение в лечении пролежней, длительно незаживающих ран, ТЯ диабетической, нейротрофической и венозной этиологии. В лечении ТЯ используют аллогенные ФБ, КЦ, дермальный эквивалент (Seidman C.S. et al., 1998; Phillips T. et al., 2002; Boyce S. et al., 2003; Hjerppe A. et al., 2004).

Наиболее широкое распространение получило использование для заживления ТЯ живого эквивалента кожи, представляющего из себя двухслойную комплексную структуру — первый слой — ДЭ, сверху его покрывает слой аллогенных кератиноцитов. Использование живого эквивалента кожи, по мнению большинства исследователей, является эффективным средством в лечении ТЯ, особенно при неэффективности стандартной терапии. Данный метод считается современной альтернативой аутодермопластики, и его применение признано весьма перспективным. Однако, дискутируется вопрос экономической оправданности метода, учитывая высокую его стоимость (Trent J. et al., 1998; Eaglstein W. et al., 1998; Pham H. et al., 1999; Brem H. et al., 2000; Veves A. et al.,2001; Ballard K. et al., 2002; Vowden К. et al., 2002).

В нашей стране опубликованы первые результаты успешного применения клеточных продуктов для лечения ТЯ венозной этиологии (Лапин А.Ю. и

34

соавт., 2004; Седов В.М., и соавт., 2006). Однако существует точка зрения и о нецелесообразности применения клеточных технологий для лечения ТЯ венозной этиологии (Савельев В.С., 2001).

Механизмы влияния аллогенных клеток на заживление ран и ТЯ до конца не ясны и находятся в настоящее время в стадии активного изучения. В частности, не определена судьба аллогенных клеток после пересадки на раневую поверхность. Высказывается предположение о том, что продолжительность жизни аллогенных клеток составляет от нескольких недель до двух месяцев (Brem H. et al., 1992, Phillips T. et al., 2000). В то же время Е.Г.

Колокольчиковой и соавт. в 2001 году выполнена попытка изучения изменений ожоговых ран после пересадки ФБ. Проводилась оценка мазков отпечатков ожоговой раны после трансплантации флюоресцентно-меченых аллогенных ФБ. Исследование отпечатков уже через 2 суток выявило почти полное отсутствие меченых клеток.

Складывается впечатление, что путь к решению вопросов влияния аллогенных клеток на раневой процесс лежит через понимание нарушений молекулярных и клеточных взаимодействий в процессе заживления ТЯ венозной этиологии (Enoch S. еt al., 2004; Hjerppe A. et аl., 2004). Факторы роста, цитокины, протеазы, клеточные элементы, компоненты ЭЦМ — это лишь основные участники и регуляторы раневого процесса, нарушение которого ведет к разбалансированности процесса и прекращению заживления,

как это происходит в ТЯ (Stanley A. et al., 1997; Mendez M. et al., 1998).

Развитие венозной гипертензии у больных с ХВН ведет к нарушению микроциркуляции и тканевого обмена. Развивающаяся в результате гипоксия, высвобождение лизосомальных ферментов, образование свободных радикалов

идр. являются факторами агрессии, не только вызывающими повреждение, но

инегативно влияющими на течение и регуляцию регенераторных процессов

(Вицлеб Э., 1996; Granger D.N. et al., 1995; Dormandу J. A. et al., 1997). В этом аспекте, в последнее время все больше работ посвящено изменению ФБ как

35

одних из основных участников процесса кожной репарации (Stanley A. et al., 1997; Agren M. et al., 1999).

При изучении ФБ, полученных из ТЯ венозной этиологии, в них обнаружены различные морфологические и функциональные нарушения

(Mendez M. et al., 1998; Vande Berg J. et al., 1998). Эти нарушения проявляются изменением формы и размера ФБ из ТЯ, по сравнению с клетками из нормальной кожи, в таких клетках снижена способность к синтезу компонентов ЭЦМ (особенно коллагена). Эти ФБ не реагируют на воздействие факторов роста (PDGF и TGF) и сами теряют возможность синтеза факторов роста, уменьшается подвижность таких ФБ и их способность к перемещению (Bucalo B. et al., 1993; Agren M. et al., 1999; Raffetto J. et al., 2001). Большое количество работ свидетельствуют о увеличении в ФБ признаков клеточного старения

(Dimri GP et al., 1995; Raffetto J. et al., 1999, 2001; Seidman C. et al., 2005).

Снижение у ФБ из ТЯ способности преобразовывать коллаген первого типа проявляется неспособностью реорганизовывать ЭЦМ, как это должно происходить при нормальном течении раневого процесса (Cook H. et al., 2000). Патологические изменения напрямую касаются и ЭЦМ, так доказано уменьшение количества и нарушение нормального соотношения типов коллагена (Herrick SE et al., 1996).

Необходимо также учитывать важность фунукций, выполняемых ФБ в ходе нормального течения раневого процесса. Заживление кожных ран является сложным многостадийным процессом и происходит в результате совместной деятельности различных типов клеток. При повреждении кожи кератиноциты, эндотелиальные клетки и ФБ взаимодействуют друг с другом через цитокины и через молекулы ЭЦМ. Внеклеточный матрикс раны формируется постепенно из исходного сгустка крови, который содержит главным образом фибрин и фибронектин плазмы (Cheng C. et al., 1988). Клеточный фибронектин секретируется макрофагами и ФБ в процессе формирования ГТ (Hynes R. et al., 1982; Clark A., 1988; Grinnel F. et al., 1987). В раневом матриксе находятся также три минорных компонента, участвующих в заживлении ран, — тенасцин,

36

тромбосподин и SPARC (Mackie E. et al., 1988; Cheng C. et al., 1988; Sage H. et al., 1989; Schalkwijik J. et al., 1991). Тромбосподин продуцируется тромбоцитами, а SPARC — ФБ и макрофагами. В ране также содержится большое количество ростовых факторов. Цитокины семейства PDGF (тромбоцитарного фактора роста) стимулируют пролиферацию клеток мезенхимального происхождения, таких как ФБ и мышечные клетки (Lin Y.-C., Grinnel F., 1993). Трансформирующий ростовой фактор (TGF-b) стимулирует хемотаксис фибробластов и продукцию ими коллагена и фибронектина (Kane C. et al., 1991). Эпидермальный фактор роста (EGF) усиливает пролиферацию и миграцию кератиноцитов. Трансфорирующий ростовой фактор TGF-a влияет на ангиогенез (Chen J. et al., 1993). Фактор роста кератиноцитов KGF значительно стимулирует заживление ран, образовавшихся после срезания расщепленных лоскутов кожи (Staiаno-Coico L. et al., 1993; Pierce G. et al., 1994). Основной фактор роста ФБ (FGF-b) положительно влияет на рост всех типов клеток в ране, стимулирует продукцию протеаз и хемотаксис не только ФБ, но и кератиноцитов (Tsuboi R. et al., 1993). Этот фактор также стимулирует продукцию компонентов внеклеточного матрикса ФБ (фибронектина и коллагена). Кроме того, FGF-b усиливает продукцию компонентов ЭЦМ кератиноцитами (Wikner N. et al., 1988). Относительно недавно был открыт NDF-фактор, влияющий на миграцию и дифференцировку клеток (Danilenko D. et al., 1995). Интерлейкин-1 (IL-1) влияет на продукцию ФБ протеогликанов и коллагена. Интересно, что кератиноциты продуцируют неактивную форму интерлейкина и лишь в случае поражения кожи, образующиеся при этом раневые протеазы превращают неактивную форму этого вещества в активную

(Mizutani H. et al., 1991).

Хотя большинство цитокинов продуцируется клетками, мигрирующими в рану, некоторые факторы при поражении кожи высвобождаются из матриксных компартментов. Раневые цитокины могут связываться с компонентами внеклеточного матрикса. Например, гепарин взаимодействует с KGF, HB-EGF, bFGF, PDGF, IL-1, IL-2, TGE-b. Связывание элементов внеклеточного матрикса

37

с цитокинами может не влиять на активность цитокинов, например, при взаимодействии фибронектина с TGF-a. В большинстве случаев связывание приводит к изменению активности цитокинов в ту или иную сторону. В частности, усиление активности происходит при взаимодействии гепарина и FGF-b. Связывание SPARC и PDGF приводит к ингибированию активности цитокина (Ramsden L. et al., 1992). Наконец, взаимодействия между цитокинами и компонентами внеклеточного матрикса могут лимитировать диффузию и растворение цитокинов. (Border W. et al., 1992).

Влияние ФБ на заживление ран связывают с их функцией синтеза компонентов ЭЦМ (коллагены, ламинин, фибронектин) (Глущенко Е.В. и

соавт., 1994; Заец Т.Л. и соавт.,1996; Grinnell F. et al., 1994; Slavin J. et al., 1996).

Не менее важной репаративных процессов функцией ФБ является выработка факторов роста, среди которых FGF-b, являющийся своеобразным «раневым гормоном» и имеющего широкую область воздействия. Этот фактор роста моделирует миграцию большинства типов клеток, осуществляет дифференцировку перицитов и ФБ, а также модулирует синтез компонентов ЭЦМ (Назаренко Г.И. и соавт., 2002; Wikner N. et al., 1987, 1988; Tsuboi R. et al., 1993). Ряд литературных источников содержит сведения о том, что ФБ интенсивно продуцируют эпидермальный фактор роста, активно влияющий на заживление ран за счет влияния на пролиферацию эпидермоцитов и эпителиальных клеток (Серов Г.Г., 1990; Парамонов Б.А. и соавт., 2000).

Несмотря на активные исследования в области клинического применения клеточных продуктов, сравнительно небольшой опыт, полученный при применении ДЭ у больных для лечения ТЯ венозной этиологии (особенно в нашей стране), а также наличие ряда нерешенных вопросов, свидетельствуют о необходимости изучения влияния аллогенных ФБ на заживление ТЯ и требует проведения дальнейших исследований.

38

Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленными в работе задачами, материалом для исследования явились 103 больных с ТЯ венозной этиологии, находившихся на лечении в клинике госпитальной хирургии № 2 ГОУ ВПО «СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова Росздрава» и отделении хирургии сосудов ФГУП РосНИИТО им. Р.Р. Вредена в период с 1999 по 2005 гг. Материалом для исследования экспериментальной части работы стали 45 крыс линии Wister.

2.1.1.Общая характеристика больных.

Увсех больных с ТЯ венозной этиологии, отобранных методом случайной выборки, имелись выраженные проявления декомпенсации ХВН, которые соответствовали VI клиническому классу классификации Объединенного совета сосудистых хирургов (С.Е.А.P., 1994).

Анамнестически у всех больных наблюдалось длительное прогрессирование симптомов ХВН с формированием к моменту поступления в стационар стойких изменений мягких тканей голеней. Длительно существующие нарушения венозного оттока у больных привели к развитию клинических признаков, характеризующих декомпенсацию ХВН — гиперпигментация и липодерматосклероз кожи, застойный дерматит,

индурация подкожно-жировой клетчатки, отек. Трофические нарушения мягких тканей локализовались в дистальных отделах голени — в 37% на уровне нижней трети голени и в 63% случаев распространялись на среднюю и нижнюю трети голени.

В зависимости от этиопатогенеза нарушений венозной макрогемодинамики и механизмам развития стойкой ХВН у 72 больных была диагностирована ВБ, а у 31 больного — ПТБ. Возраст больных составлял от 38 до 74 лет. В том числе 66 (65%) женщин и 37 (35%) мужчин. Распределение больных по возрасту, полу и заболеваниям представлено в табл. 1.

39

Таблица 1. Распределение больных по возрасту, полу, заболеваниям

Длительность существования венозной патологии (с момента появления первых симптомов венозной недостаточности) составила в среднем 18,8±1,7лет у больных с ПТБ и 22,6±2,1 лет у больных с ВБ.

Варикозное расширение большой подкожной вены (БПВ) было выявлено у 63 пациентов (87,5%), сочетание поражения БПВ и малой подкожной вены (МПВ) у 9 пациентов (12,5%). В 33% случаев варикозная болезнь выявлена на левой нижней конечности, в 36% на правой, а в 31% отмечалось варикозное расширение вен обеих нижних конечностей. В случаях поражения ВБ обеих нижних конечностей в настоящем исследовании включены результаты лечения конечности, на которой сформировалась ТЯ. Перенесли в прошлом тромбофлебит поверхностных вен 14 пациентов. В числе больных было 8 пациентов, ранее прооперированных по поводу ВБ, развитие признаков декомпенсации венозного кровотока возникли у этих больных в среднем через 5,6±0,9 лет после выполненной операции.

В соответствии с классификацией А.Н. Веденского (1983) у 58 больных была диагностирована поверхностная форма ВБ, характеризующаяся наличием варикозно расширенных поверхностных вен и несостоятельностью клапанного аппарата магистральных и перфорантных вен, при отсутствии изменений функционального характера со стороны системы глубоких вен. У 14 пациентов при обследовании выявлена сочетанная форма заболевания, для которой, наряду