2 курс / Нормальная физиология / Физиолого_биохимические_основы_мышечной_деятельности_Еликов_А_В
.pdf61
ге, накапливается большое количество ПВК и увеличивается её выведение с мочой. Содержание этой кислоты в крови и моче возрастает при сахарном диа-
бете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой си-
стемы.
Определение пирувата в крови
Реактивы:
1.Трихлоруксусная кислота (ТХУ), 10% раствор;
2.2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ), раствор 10 мг/100 мл;
3.Натрия гидроксид, 10% раствор.
Ход определения
Реагент Опытная проба, мл Холостая проба, мл Капиллярная кровь0,3- Дистиллированная вода0,7 1,0Перемешивают стек-
лянной палочкой для полноты гемолиза эритроци-
тов ТХУ1,0 1,0Перемешивают стеклянной палочкой, выдерживают
3 минуты и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 ми-
нут Центрифугат1,8 1,8ДНФГ0,4 0,4Перемешивают и вы-
держивают 20 минут в темном местеNaOH 1,0 1,0
Опытная проба, мл
ТХУ1,0 1,0Перемешивают стеклянной палочкой, выдерживают 3 ми-
нуты и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 ми-
нут Центрифугат1,8 1,8ДНФГ0,4 0,4Перемешивают и вы-
держивают 20 минут в темном местеNaOH 1,0 1,0 1,0
Центрифугат1,8 1,8ДНФГ0,4 0,4Перемешивают и выдерживают
20 минут в темном местеNaOH 1,0 1,0
1,8
NaOH 1 1
, ,
0 0
62
Перемешивают, выдерживают 5 минут и колориметрируют в кюветах с толщиной оптического слоя 5 мм при длине волны 450 нм против холостой пробы. Аналогично обрабатывают стандартные растворы, вместо центрифугата и в таком же объеме. Расчет ведут по калибровочному графику.
Контрольные вопросы
1.Какой субстрат участвует в энергетическом обеспечении мышечной дея-
тельности?
2.Какую роль играет витамин В1 в энергетическом обеспечении мышечной де-
ятельности?
3.В состав каких сложных ферментных систем входит ТПФ?
4.С какими пищевыми источниками поступает в организм витамин В1?
5.Как проводят количественное определение пировиноградной кислоты в мо-
че?
6.Как определяют содержание пирувата в крови?
2.4. Биохимические основы функционирования фосфагенного
пути ресинтеза аденозинтрифосфата
1. Биохимические основы функционирования системы креатин-
креатинфосфат-креатинин. Данная система обеспечивает регенерацию адено-
зинтрифосфата (АТФ) непосредственно на миофибриллах первые несколько секунд работы. Данная система наибольшее значение имеет для спортсменов,
тренирующихся в ациклических видах спорта, особенно в тех упражнениях, ха-
рактер которых связан со взрывным типом мышечной деятельности - бег на ко-
роткие дистанции, прыжки и др. Следует отметить, что элементы взрывного характера мышечной деятельности присутствуют и игровых видах спорта.
Биосинтез креатина протекает в две стадии из 3-х аминокислот: аргинина,
глицина и метионина.
HN = C – NH2
|
|
|
|
|
|
63 |
|
NH |
СООН |
глицинамидинотрансфераза |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
(CH2)3 + |
CH2 |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
CH - NH2 |
NH2 |
|
|
|
|||
COOH |
|
|
|
|
|
|
|
аргинин |
|
|
|
глицин |
|
|
|
HN = C – NH2 |
NH2 |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
NH |
+ |
(CH2)3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CH2 |
|
CH - NH2 |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
COOH |
|
COOH |
||
гуанидинацетат |
|
орнитин |
|||||
|
(гликоциамин) |
|
|
Схема 7. Образование гуанидинацетата
1-я стадия. Биосинтез гуанидинацетата - осуществляется в почках при участии фермента глицинамидинотрансферазы (схема 7).
2-я стадия. Протекает в печени при участии фермента гуанидинацетатме-
тилтрансферазы. Донором метильной группы в данной реакции является акти-
вированный метионин - S-аденозилметионин.
NH2 |
NH2 |
||
|
|
|
|
C = NH |
C = NH |
||
|
|
|
|
NH + S-аденозилметионин |
N - СН3 + S-аденозилгомоцистеин |
||
|
|
|
|
CH2 |
CH2 |
||
|
|
|
|
COOH |
COOH |
||
гуанидинацетат |
креатин |
Схема 8. Превращение гунидинацетата в креатин
Образовавшийся креатин с током крови выносится из печени и поступает в мышечную ткань, где в митохондриях фосфорилируется митохондриальной фракцией креатинфосфокиназы (КФК) при участием АТФ с образованием спе-
цифического макроэрга мышечной ткани - кретинфосфата.
|
|
|
64 |
|
|
NH |
|
NH |
|
||
|
|
|
|
|
|
C-NH2 |
|
C |
-NH-PO3H2 |
|
|
|
|
|
КФК |
|
|
N-CH3 |
+ АТФ |
N-CH3 |
+ АДФ |
||
|
|
|
|
|
|
|
CH2 |
|
CH2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
COOH |
COOH |
|
|||
креатин |
креатинфосфат |
|
Схема 9. Образование креатинфосфата из креатина
Образовавшийся креатинфосфат диффундирует к сократительным эле-
ментам цитоплазмы - миофибриллам, где передает свою фосфатную группу на АДФ с помощью цитоплазматической креатинфосфокиназы и образованием
креатинина. |
|
|
||
NH |
NH |
|||
|
|
|
|
|
C - NH - PO3H2 |
C - NH |
|||
|
|
КФК |
|
C = O + H3PO4 |
N - CH3 |
H3C - N - CH2 |
|||
|
|
|
|
|
CH2 |
|
|
||
|
|
|
|
|
COOH |
|
|
||
креатинфосфат |
креатинин |
|||
|
|
|
Схема 10. Образование креатинина |
Креатинин является конечным продуктом обмена, не вступает ни в какие химические превращения и выделяется через почки с мочой. Таким образом,
креатинин является нормальным компонентом мочи. Установлена зависимость между объемом мышечной ткани и содержанием креатинина в крови - чем больше мышечная масса, тем больше содержание креатинина. В среднем, у
мужчин содержание креатинина в крови больше чем у женщин.
Определение креатинина в моче
65
Клинико-диагностическое значение метода: выведение креатина и креа-
тинина с мочой указывает на состояние мышечной системы организма. Креати-
нин непрерывно образуется в мышцах из креатинфосфата. Обратный процесс невозможен, поэтому креатинин, попадающий в кровоток, активно секретиру-
ется в мочу и быстро выводится. Количество выводимого креатинина является постоянным у каждого человека вне зависимости от объема мочи и количества поступающего с пищей азота. Это позволяет использовать креатинин как точку отсчета для сопоставления с другими веществами, выводимыми с мочой.
Количество креатинина в моче зависит от мышечной массы тела (10-25
мг/1кг массы) и в норме за сутки выделяется 4,4-17,6 ммоль/сут, или 53,0-106,1
мкмоль/л. Гиперкреатининурия наблюдается при синдроме длительного сдав-
ливания, после снятия кровоостанавливающего жгута, лихорадочных состояни-
ях, пневмонии, после тяжелой мышечной работы. Гипокреатининурия отмеча-
ется при хроническом нефрите, мышечной атрофии, дегенерации почек, лейке-
мии, в старческом возрасте. Креатин в моче взрослого человека отсутствует,
так как используется повторно для синтеза креатинфосфата и полностью реаб-
сорбируется в почечных канальцах. Однако у детей, беременных женщин и в послеродовом периоде, а также у подростков моча почти всегда содержит креа-
тин. Креатинурия у взрослых указывает либо на поражение мышечной ткани,
либо на уменьшение ее массы (голодание, мышечные дистрофии и т.д.).
Реактивы:
1.ТХУ, 1,22 моль/л (депроитеинизирующий раствор);
2.Пикриновая кислота, 0,04 моль/л;
3.NaOH, 0,75 моль/л;
4.Эталон креатинина - раствор 177 мкМ/л.
Принцип метода. Креатинин при взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде образует окрашенные соединения, интенсивность окраски которых измеряют фотометрически при длине волны 500-510 нм.
Ход работы
66
Мочу перед исследованием развести в соотношении 1 100 дистиллиро-
ванной водой.
1. В три стеклянные пробирки отмерить компоненты, перечисленные в таблице, и их содержимое перемешать.
|
Отмерить (мл) |
Проба |
Эталон |
Контроль |
|
|
|
|
|
1. |
Разведенная моча |
0,50 |
- |
- |
|
|
|
|
|
2. |
Калибровочный раствор |
- |
0,25 |
- |
(эталон креатинина |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3. |
Вода дистиллированная |
0,25 |
0,50 |
0,75 |
|
|
|
|
|
4. |
Депротоинирующий раствор |
0,25 |
0,25 |
0,25 |
|
|
|
|
|
5. |
Пикриновая кислота |
0,50 |
0,50 |
0,50 |
|
|
|
|
|
6. |
Раствор гидроксида натрия |
0,50 |
0,50 |
0,50 |
|
|
|
|
|
2.Через 20 мин измерить оптическую плотность пробы (А1) и эталона (А2)
против контрольного раствора.
3.Расчет произвести по формуле:
Креатинин (мкмоль/л)=177 А1/А2
Учитывая разведение мочи, результат умножить на 50.
2. Ресинтез АТФ за счет АДФ (миокиназная реакция). Происходит путем вза-
имодействия 2-х молекул АДФ, одна из которых передает свою концевую
фосфатную группу другой молекуле, превращаясь в молекулу АМФ.
2 АДФ |
миокиназа |
АТФ + АМФ |
|
АМФ может дезаминироваться и потерять способность ресинтезироваться, что не желательно. При мышечной деятельности эта реакция идет только в случае значительного утомления, когда ресинтез АТФ за счет других механизмов за-
труднен. Это последний, аварийный путь ресинтеза, происходящий в анаэроб-
ных условиях.
Образование аммиака в мышцах
67
В работающей мышце образуются значительные количества аммиака.
Непосредственным источником аммиака служит дезаминирование АМФ: АМФ + Н2О ИМФ + NH3
Однако АМФ вновь регенерируется с использованием аминогруппы ас-
парагиновой кислоты:
ИМФ + Аспартат + ГТФ АМФ + Фумарат + ГДФ + Н3РО4
Фумарат затем превращается в оксалоацетат и далее при участии аспарта-
таминотрансферазы (АСТ) в аспартат, что объясняет достаточно высокую ак-
тивность этого фермента в мышечной ткани. Интенсивная мышечная деятель-
ность сопровождается активацией свободнорадикальных реакций и приводит к повреждению мембран мышечных клеток с выходом АСТ в общий кровоток,
что сопровождается увеличением активности данного фермента в крови. Таким образом, активность АСТ в крови после выполнения физической нагрузки слу-
жит критерием напряженности мышечной работы.
Аминокислоты |
б-Кетоглутарат |
Аспартат |
ИМФ |
NН3 |
б-Кетокислоты |
Глутамат |
|
АМФ |
|
|
Оксалоацетат |
Фумарат |
|
Малат
Схема 11. Образование аммиака при мышечной работе
Исходя из сказанного, первичным источником аммиака можно считать аспарагиновую кислоту и другие аминокислоты, которые трансаминируются с оксалоацетатом. Вероятно, эта система реакций служит для непрямого дезами-
нирования аминокислот, а образующиеся кетокислоты используются в качестве источника энергии. Можно предположить, что образовавшийся аммиак транс-
портными формами доставляется в печень, где вступает в цикл образования мочевины. Таким образом, содержание мочевины в крови после выполнения физической нагрузки также может служить критерием напряженности мышеч-
ной деятельности.
68
Кроме того, аммиак может предотвращать подкисление среды образую-
щейся при гликолизе молочной кислотой, что совместно с содержанием в рабо-
тающей мышце АМФ служит важным механизмом регуляции следующего ме-
ханизма регенерации АТФ - анаэробного гликолиза.
Контрольные вопросы
1.Из каких аминокислот происходит биосинтез креатина?
2.Какие основные стадии биосинтеза креатина существуют?
3.Какова биологическая роль кретинфосфата в организме?
4.С какой целью проводят определение креатинина в моче?
5.На чем основан метод определения креатинина в моче?
6.Как происходит образование аммиака в мышцах?
69
2.5. Биохимические основы функционирования
лактацидного пути ресинтеза аденозинтрифосфата
В анаэробном гликолизе в качестве источника энергии используется глю-
коза, которая образуется в форме глюкозо-6-фосфата при распаде гликогена мышц, а также поступает из крови. Анаэробный гликолиз включает 11 после-
довательных реакций (схема 12) с выходом энергии в виде двух молекул АТФ
АТФ АДФ
Глюкоза |
Глюкозо-6-фосфат |
|
Фруктозо-6-фосфат |
|
1 |
|
2 |
АТФ АДФ |
|
ДАФ |
2НАД+ 2НАДН•Н+ |
|
4 |
|
5 |
|
Фркутозо-1,6-дифосфат |
|
ГАФ (2) |
3 |
|
|
4 |
6 |
|
|
|
2АДФ 2АТФ
2H3PO4
1.3-дифосфоглицерат (2) |
3-фосфоглицерат (2) |
7
8
|
Н2О (2) |
2АДФ 2АТФ |
2-фосфоглицерат (2) |
Фосфоенолпируват (2) |
|
8 |
9 |
|
2НАДН•Н+ |
2НАД+ |
|
Пируват (2) |
Лактат (2) |
|
10 |
11 |
|
Схема 12. Последовательность реакций гликолиза
70
(в случае глюкозо-6-фосфата - трех) и образование в качестве конечного про-
дукта молочной кислоты (лактата). Гликолиз можно рассматривать как внут-
ренний окислительно-восстановительный процесс, в котором образование двух молекул НАДН·Н+ на стадии дегидрирования глицеральдегид-3-фосфата, а ак-
цептируется водород двумя молекулами пирувата с образованием лактата. Сле-
дует отметить, что 11-я реакция, катализируемая лактатдегидрогеназой (ЛДГ)
является характерной именно для анаэробного гликолиза, поскольку в аэроб-
ных процессах, образующийся в ходе 10-й реакции пируват диффундирует в митохондрии, где подвергается окислительному декарбоксилированию.
Таким образом, активность гликолиза в скелетных мышцах достаточно ве-
лика, а изофермент ЛДГ5 является специфичным для мышечной ткани. Лактат,
далее ни в какие химические превращения не вступает и может превращаться только в пируват в обратной лактатдегидрогеназной реакции. Накопление лак-
тата приводит к сдвигу рН в кислую сторону и ингибированию гликолиза, что приводит к дефициту энергии и ограничению мышечной работоспособности.
Содержание лактата в процессе выполнения дозированной физической нагрузки и восстановительного периода является одним из ключевых показате-
лей оценки степени тренированности. Схема реакций гликолиза представлена ниже:
Суммарное уравнение гликолиза выглядит следующим образом:
Глюкоза + 2 Н3РО4 + 2 АДФ 2 Лактат + 2 АТФ + Н2О
Содержание молочной кислоты не только характеризует степень участия анаэробных процессов, но и ограничивает работоспособность. Вместе с тем,
быстрота получения энергии делает анаэробный механизм особенно актуаль-
ным для спортсменов скоростно–силовых видов спорта. Однако, степень тре-
нированности характеризуют не только образование, но и быстрота утилизации лактата в восстановительный период. Существуют 4 основных пути устранения молочной кислоты:
1)окисление до углекислого газа и воды (так устраняется 70% лактата, но этот процесс требует поступления достаточного количества кислорода);