2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология_Якубик_О_Л_,_Литвинова_З_А_2021

131

сутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

2.Обнаружение антител в исследуемой сыворотке крови проводят роз-бенгал пробой. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовымбенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно смешивают покачиванием стекла и через 4 минуты учитывают результат.

Учет результатов. При положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобного типа относится к качественной, так как с

еепомощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Пробирочная РА.

1.Схема постановки РА представлена в таблице 4. Из 5-й пробирки удаляют 0,5 мл жидкости перед до-

бавлением антигена. Одновременно по аналогичной схеме исследуют заведомо положительную и отрицательную сыворотки (положительный и отрицательный контроли).

Учет результатов начинают с контрольных пробирок – не должно быть спонтанной (неспецифической) агглютинации в 6-й пробирке (контроль антигена) и хлопьев осадка в 1-й пробирке (контроль сыворотки). В остальных пробирках наличие и интенсивность агглютинации учитывают визуально и оценивают в крестах:

++++ - полная агглютинация – хорошо выраженный осадок и полное просветление жидкости (агглютинировало 100% антигена);

+++ - неполная агглютинация с хорошо выраженным осадком и со слабой опалесценцией жидкости (агглютинировало 75% антигена);

133

цию минимум на два креста или более, называют титром сыворотки. Титр сыворотки отражает количественное содержание антител в крови исследуемого животного.

Пробирочную РА используют не только для серодиагностики инфекционных болезней, но также для оценки активности диагностических агглютинирующих сывороток или интенсивности поствакцинального иммунологического ответа.

Количество антител может служить диагностическим критерием. Под диагностическим титром понимают минимальное количество антител к данному антигену в исследуемой сыворотке, заведомо превышающее количество нормальных антител к используемому в реакции антигену в сыворотке животного того же вида. При диагностическом титре антител и выше животное рассматривают как больное или переболевшее.

При некоторых инфекциях этот подход не всегда продуктивен, и тогда исследуют «парные сыворотки», то есть сыворотки, взятые от животного дважды с интервалом три-четыре недели. Причем первую пробу необходимо брать не позднее двух-трех суток после появления клинических симптомом болезни. На активный инфекционный процесс указывает существенное повышение титра антител во второй пробе.

2. Для идентификации микроорганизмов используют пробирочную РА, если из-за антигенного родства с различными видами или внутривидовым сероварами в РА на стекле микроорганизм идентифицировать не удалось.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Данную реакцию относят к серологической реакции осадочного типа. В ней используют растворимые микробные антигены, сорбированные на эритроцитах как носителях (антигенный диагностикум), или сорбированные на эритроцитах антитела известной иммунной сыворотки

135

варительно адсорбируют несенсибилизированными эритроцитами.

РНГА на стекле применяют для диагностики пуллороза – тифа птиц (качественная кровекапельная реакция непрямой гемагглютинация – ККРНГА). На сухое обезжиренное стекло глазной пипеткой наносят антиген и свежую кровь, взятую из гребня или подкрыльцовой вены птицы, и смешивают, покачивая стекло. Реакцию считают положительной при выпадении в течение двух минут в смеси крови с антигеном хлопьев коричневого цвета. Параллельно ставят контроли с позитивной и негативной сыворотками.

Пробирочная РНГА рекомендована для серологической диагностики многих инфекционных болезней. Например, для диагностики сальмонеллезов используют количественную РНГА. Эритроцитарный антиген содержит О-антигены сальмонеллы. Исследуемую сыворотку разводят физиологическим раствором в полистероловых планшетах в объеме 0,5 мл от разведения 1:100 до 1:800. Затем в каждую лунку вносят 0,25 мл диагностикума. Компоненты перемешивают покачиванием планшета и выдерживают в термостате при 37°С 2-2,5 часа.

Результат РНГА оценивают в крестах:

1)++++ - все эритроциты агглютинированы и в виде «зонтика» покрывают дно лунки;

2)+++ - агглютинированы почти все эритроциты; на фоне «зонтика» сформировано малозаметное кольцо из осевших неагглютинированных эритроцитов;

3)++ или + - «зонтик» плохо выражен, заметен осадок из неагглютинированных эритроцитов в виде кольца;

4)- - эритроциты не склеены и осели на дно в виде узкого колечка с ровными краями, либо в виде пунктата или колечка.

Параллельно ставят контроли с заведомо положительной и отрицательной сыворотками.

137

РСК применяют как метод серологической диагностики и реже для обнаружения микробных антигенов в исследуемом материале. В РСК с одинаковым успехом можно использовать корпускулярные и растворимые антигены.

Комплимент не способен соединяться с антигеном (АГ) или с антителами (АТ) в отдельности, но реагирует с образовавшимся комплексом АГ-АТ. В РСК участвуют две системы АГ-АТ и комплимент.

Исследуемая АГ-АТ система: искомый компонент в ней может количественно варьировать или полностью отсутствовать. При взаимодействии комплимента с системой АГ-АТ видимые феномены отсутствуют.

Индикаторная АГ-АТ система состоит из эритроцитов барана (антиген) и гемолизина (антитела к эритроцитам барана). При взаимодействии комплимента с системой АГ-АТ наблюдают процесс иммунного лизиса эритроцитов. На конкуренции исследуемой и индикаторной систем АГ-АТ за комплимент основана диагностическая РСК.

РСК ставят в два этапа. Сначала в пробирку вносят исследуемую сыворотку крови, известный антиген и комплимент. Смесь реагентов выдерживают в водяной бане при 37°С 20-30 минут. Независимо от результата видимых изменений в пробирке не происходит. Чтобы выяснить результат, в пробирку вносят индикаторную систему (вторая фаза). После инкубирования всех компонентов учитывают результаты.

Компоненты РСК. При введении всех компонентов в строго определенном количественном соотношении реакция дает достоверные и воспроизводимые результаты.

В качестве солевого раствора для разведения компонентов используют физиологический раствор. Более стабильные результаты иммунного гемолиза получают при введении в раствор ионов Ca2+ и Mg2+ поскольку они

139

мента гемолизин способен обеспечить полный лизис суспензии эритроцитов.

При титровании готовят вспомогательные разведения гемолизина (табл. 5). Их переносят в 8 пустых пробирок и добавляют другие компоненты (табл. 6)

Вприведенном примере титр гемолизина составляет 1:2000 (четвертая пробирка). Для постановки РСК обычно берут удвоенное количество гемолизина – в данном случает 1:1000 (рабочий титр).

Титрование комплимента. Комплимент титруют каждый раз в день постановки главного опыта РСК. За титр комплимента принимают его минимальное количество, которое вызывает полный лизис определенной дозы суспензии эритроцитов в присутствии рабочей дозы гемолизина. Комплимент титруют в гемолитической или бактериологической системе.

Титрование комплимента в гемолитической системе, например, может быть проведено по указанной схеме

(табл. 7)

Вданном примере титр комплимента составил 0,1 мл. Активность комплимента может снижать антиген и исследуемая сыворотка (антикомплиментарное действие). Чтобы нивелировать антикомплиментарность компонентов, комплимент берут в опыт на 20-40-процентный больше установленного титра. Для более точного определения титра рекомендуют титровать комплимент в присутствии сыворотки крови и антигена (титрование в бактериологической системе).

Например, при серодиагностике бруцеллеза комплимент титруют на негативной и позитивной сыворотках, полученных от животных того же вида, что и исследуемая сыворотка.

Таблица 5 - Приготовление вспомогательного ряда разведений гемолизина

140

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/