6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

Модуль 5. Методы выявления возбудителя туберкулеза

иопределения лекарственной чувствительности с использованием автоматизированных

иполуавтоматизированных систем

Тема 5.1. «Правила и методы пробоподготовки диагностических материалов для использования на автоматизированных и полуавтоматизированных системах»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•устройства автоматизированных и полуавтоматизированных систем, принципы работы и регистрации роста микроорганизмов;

•характеристики устройств, требования к обеспечению их работоспособности;

•подготовка реактивов и реагентов для пробоподготовки;

•рабочий алгоритм и протокол пробоподготовки;

•особенности пробоподготовки различных диагностических материалов;

•стерильность материалов и причины контаминации;

•особенности выделения культур и их идентификации.

Цель – формирование у слушателей представлений об особенностях и правилах пробоподготовки диагностических материалов для использования на автоматизированных системах в общем алгоритме работы.

Вводная часть (5–10 мин)

В вводной части лекции даются представления о недостатках классических методов культуральной диагностики туберкулеза и микобактериозов, о современных направлениях совершенствования и развития инноваций в данной области (культивирование, детектирование, деконтаминация). В 1958 г. Мидлбрук и Кон предложили среду на основе агара, которая может обеспечить более быстрый рост микобактерий. В 1969 г. Деланд и Вагнер разработали методику полуавтоматического определения метаболизма бактерии путем измерения количества 14СО2, освободившегося в процессе роста. В 1980 г. данный метод был внедрен для выделения микобактерий из клинических образцов, а также для постановки тестов на лекарственную чувствительность. Одним из недостатков системы ВАСТЕС 460 ТВ является использование радиоактивного

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

Пробирки MGIT инкубируются при температуре 37°С с последующим анализом, осуществляемым вручную при ультрафиолетовом излучении, либо путем помещения в прибор ВАСТЕС MGIT 960, где пробирки проходят инкубацию и мониторинг степени флюоресценции каждые 60 минут. Рост микобактерий и других бактерий вызывает усиление флюоресценции. В случае с М.tuberculosis в момент положительного посева пробы наблюдается около 105–106 колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл среды. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).

В основе теста на лекарственную чувствительность микобактерий туберкулеза лежит модифицированный метод пропорций. В процессе определения происходит сравнение скорости роста микобактерий туберкулеза – в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора ВАСТЕС MGIT 960, который автоматически интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности к препарату.

Первичная обработка материала

Для выявления микобактерий туберкулезной природы и нетуберкулезных видов с помощью BACTEC MGIT 960 предпочтительно использовать образцы мокроты и диагностических материалов, не содержащих кровь и не изменяющих кислотность питательной среды в кислую сторону (например, моча с большим содержанием фосфатных и многоосновных солей органических кислот). Для обеспечения оптимальной производительности труда, соблюдения всех рекомендуемых параметров и предотвращения кросс-контаминации образцов рекомендуется одновременная обработка не более 10 образцов на одного работающего.

При приготовлении реактивов уделяется внимание их использованию ex temporae или длительного хранения. Например, для разжижения и деконтаминации мокроты готовят свежий раствор N-ацетил-L-цистеина и NaOH. Конечная концентрация щелочи (гидроокиси натрия) в образце должна составлять 1%.

Для предотвращения перекрестной контаминации при работе в шкафу биобезопасности одномоментно может быть открыта только одна пробирка с образцом.

Полученный материал используют в следующем порядке: 1) для посева в пробирки MGIT; 2) для посева на плотные питательные среды; 3) для изготовления мазков. Если материал не используется немедленно, он должен быть заморожен при – 20°С. Мате-

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

риал рекомендуется сохранять по меньшей мере в течение 1–2 недель, так как он может понадобиться для повторного посева в случае контаминации.

Выделение микобактерий из контаминированных образцов

Если контаминация подтверждена, а результат микроскопии положительный, необходимо произвести повторную деконтаминацию и попытаться выделить чистую культуру микобактерий. Необходимо решить вопрос о целесообразности продолжения работы с контаминированным образцом, если контаминация остальных посевов от данного пациента не выявлена. Если важно продолжить работу именно с данным посевом (а именно: контаминированный образец является единственным образцом, полученным от данного пациента), необходимо сделать провести повторную обработку культивированного материала.

Причины возникновения контаминации и ее предупреждение. Организуйте рабочее место так, чтобы избежать кросс-контаминации образцов и предметных стекол. Уровень контаминации до 5–8% от общего количества образцов может считаться приемлемым. При повышении уровня контаминации выше 10% необходимо принимать меры по выявлению причин контаминации и ее снижению. Если контаминация происходит часто (т.е. более 10% посевов контаминировано) и является проблемой, рекомендуются следующие меры по ее предотвращению:

Проверьте время между сбором и началом обработки материала. Важным фактором предупреждения контаминации является сокращение времени хранения мокроты, чем предупреждается ее заселение посторонней флорой. Если все же необходимо хранить мокроту, необходимо хранить ее в холодильнике.

Если транспортировка долгая, обеспечьте охлаждение образцов в пути до 6–8°С.

Если контаминация происходит регулярно, а ее причиной являются одни и те же виды бактерий, причина, скорее всего, в недостаточной чистоте реактивов и проблеме со стерильностью реагентов и посуды.

Если жидкие материалы сворачиваются, добавляйте антикоагулянты на этапе сбора материала.

Общим правилом является аликвотирование растворов небольшими объемами. Каждый раз используется, таким образом, свежий раствор, неиспользованный объем раствора не хранится, а уничтожается.

В процессе деконтаминации мокроты раствором NALC-NaOH важно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы действию раствора подверглись все участки внутренних стенок пробирки, особенно в верхней части.

Используйте последовательные шаги для преодоления контаминации.

Не изменяйте сразу несколько параметров одновременно, попробуйте вначале один способ и задокументируйте результаты. Если они неудовлетворительны, попробуйте другой способ.

Изучение первичной культуры микобактерий с помощью системы MGIT

Следует помнить об особенностях работы прибора в связке с индикатором роста в пробирке MGIT.

Ежедневно проверяйте показания прибора на предмет наличия положительных и отрицательных результатов.

Первичная идентификация выросшей культуры микроорганизмов.

Содержимое из «положительной» пробирки должно быть использовано (в указанном порядке) для:

•посева на кровяной агар для контроля контаминации;

•субкультивирования на средах Левенштейна-Йенсена и на среде с натрий салициловокислым/пара-нитробензойной кислотой;

•приготовления мазков с окраской по методу ЦН. Микроскопия мазков проводится обычным способом под им-

мерсионным объективом (х100). Наличие кислотоустойчивых колоний в виде «кос», как правило, означает наличие микобактерий туберкулеза. Наличие отдельных кислотоустойчивых бактериальных клеток требует идентификации культуры.

Если результаты микроскопии материала из пробирки, отмеченной как положительная системой MGIT, являются отрицательными, а среда прозрачная и нет иных подозрений на контаминацию, рекомендуется поместить пробирку обратно в систему для последующего мониторинга. Рекомендуется повторить отбор материала для мазков и микроскопию через 3 дня. Если результаты микроскопии мазков остаются отрицательными, контаминация отсутствует (рост на кровяном агаре), визуальных признаков роста

впробирке нет, а на среде Левенштейна-Йенсена роста также нет

втечение 10 недель, выдается отрицательный ответ. Подтверждение случая выделения микобактерий туберкулеза

устанавливается с помощью одного из иммунохроматографических тестов. Для данных случаев следует обратить внимание на

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ограничение использования тестов по аналитической чувствительности.

Для контроля контаминации следует произвести посев содержимого пробирки MGIT на чашки с кровяным агаром и инкубировать в течение 24-х часов в термостате при +36°С. Наличие роста микроорганизмов на чашке свидетельствует о контаминации материала.

Заключение

Для закрепления необходимо кратко перечислить основные моменты пробоподготовки материалов для использования в системе культивирования BACTEC MGIT 960. Следует помнить об ограничениях используемых технологий и высокого риска контаминации при отступлении от правил пробоподготовки диагностических материалов.

Рекомендуемая литература

1.Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S.,Rusch-Gerdes S. Руководство. Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.

2.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство по работе с системой BACTEC MGIT 960 // FIND diagnostics. – 2006. – 74с.

3.Siddiqi S H. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB system. Sparks, MD, USA: Becton Dickinson. – 2005. – p 81–84.

4.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S., Alexander H. et al. MGIT Procedure Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for Manual MGIT) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Culture and Drug Susceptibility Demonstration Projects – 2007.

5.Recommendations from CDC and the Association of Public Health Laboratories Task Force on Tuberculosis Laboratory.

Материально-техническое обеспечение

Мультимедийная или проекционная демонстрационные системы, экран, лазерная указка; набор тематических слайдов.

Тема 5.2. «Изучение лекарственной чувствительности на автоматизированных и полуавтоматизированных системах»

Количество аудиторных часов – 1

Примерный план лекции

Основные вопросы, освещаемые в лекции:

•изучение протокола постановки тестов лекарственной чувствительности; Цель – формирование у слушателей представлений о выпол-

нении основных правил протокола постановки тестов лекарственной чувствительности на автоматизированных системах культивирования.

Вводная часть (5–10 мин)

В связи с положениями, указанными в Приказах МЗ РФ №109 от 21.03.2003 и №1224н от 29-12-2010, предусматривающих использование укоренных культуральных исследований на жидких питательных средах в целях диагностики туберкулёза, эти методы и технологии получили широкое распространение. Это оправдано, так как позволяет быстро выявить бактериовыделение и определить лекарственную чувствительность микобактерий туберкулёза к противотуберкулёзным препаратам. Однако, при анализе учета получаемых результатов исследований следует помнить о том, что они должны оцениваться в комплексе с исследованиями на плотных питательных средах с учетом в разнице принципов методов абсолютных концентраций и на автоматизированных системах, о чем указывает производитель.

Основная часть (30 мин)

Тесты на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) должны проводиться по следующей схеме:

•Положительный результат на системе MGIT И положительный результат на плотной среде Л-Й:

Культура MGIT ТЛЧ MGIT Культура Л-Й ТЛЧ Л-Й

•Положительный результат на системе MGIT И отрицательный результат на плотной среде Л-Й:

Культура MGIT ТЛЧ MGIT

ТЛЧ Л-Й

•Отрицательный результат на системе MGIT И положительный результат на плотной среде Л-Й:

Культура Л-Й ТЛЧ MGIT ТЛЧ Л-Й

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Подготовка к проведению ТЛЧ в системе BACTEC MGIT 960.

Стандартные концентрации препаратов для использования в системе MGIT (мкг/мл):

STR 1,0; INH 0,1; RIF 1,0; EMB 5,0; PZA 100,0

Приготовление суспензии микобактерий (после культивирования в пробирке MGIT) для ТЛЧ

Важным фактором является «возраст» культуры в днях, прошедших с момента индикации «ПОЛОЖИТЕЛЬНО» в системе MGIT.

День, в который данная культура была впервые идентифицирована системой как положительная, считается «НУЛЕВЫМ» (день 0).

Для получения культуры, пригодной к дальнейшим тестам на ТЛЧ, пробирку необходимо инкубировать в системе BACTEC по меньшей мере еще сутки (т.е. до дня 1). Если пространство в системе является критичным фактором, сдерживающим скорость работы, пробирка может быть удалена из системы после дня 0 (т.е. после получения положительного ответа) и культивироваться в последующие дни в термостате при 37°С.

Культура является пригодной для посева на ТЛЧ в течение ПЯТИ дней, следующих за днем 0.

Если культура инкубировалась в системе или термостате более 5 дней после сообщения о положительном результате (т.е. начиная

сдня 6 и далее), она НЕПРИГОДНА к проведению ТЛЧ в системе MGIT. С целью проведения ТЛЧ на этой культуре небольшой объем 0,5 мл этой культуры необходимо посеять в свежую пробирку MGIT и культивировать как обычно для получения положительного ответа.

Процедуры подготовки культуры для ТЛЧ несколько различаются в зависимости от «возраста» культур (т.е. дней, прошедших

смомента получения положительного результата).

Приготовление суспензии микобактерий (после культивирования на плотных средах) для посева на ТЛЧ

Используйте для постановки ТЛЧ культуру с плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена НЕ СТАРШЕ 15 ДНЕЙ с момента появления роста микобактерий.

Мутность полученной суспензии культуры контролируют по стандарту мутности (она должна быть больше 0,5 ед.). Полученную суспензию разводят в соотношении 1:5 стерильным изотоническим раствором и это разведение (1:5) используют для инокуляции в пробирки MGIT с препаратами.

Инокуляция и инкубация

Впромаркированные пробирки без препаратов вносят 0,5 мл разведения 1:100, которые используют для контроля роста микобактерий при тестировании на чувствительность к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу.

Впромаркированные пробирки без препаратов вносят 0,5 мл разведения 1:10, которые используют для контроля роста микобактерий при тестировании на чувствительность к пиразинамиду.

Вкаждую из пяти пробирок с препаратом (S,I,R,E и PZA) вносят по 0,5 мл суспензии микобактерий 1:5, полученной из культуры, выращенной на плотной среде или суспензии 1–2-дневной культуры микобактерий или разведения 1:5 3–5 дневной культуры микобактерий, выращенных в системе MGIT.

Длительность проведения ТЛЧ в системе обычно составляет от 4 до 21 дня. Система MGIT проводит автоматический мониторинг роста микобактерий и сообщает о завершении теста при достижении определенного значения единиц роста в контрольной пробирке. При получении такого сообщения все пробирки, в которые был посеян данный материал, могут быть извлечены из прибора и отсканированы для получения окончательного результата исследования. Результат выдается системой в виде сообщений “R – Resistant” (устойчив) либо “S – Sensitive” (чувствителен). Определение результатов системой производится путем измерения интенсивности свечения в пробирках с препаратами и контрольной пробирки.

При наличии роста в контрольных пробирках ранее 4-го дня (что может свидетельствовать о контаминации), либо его отсутствии по истечении 21 дня, система выдает сообщение “X – Error” ошибка. Это же сообщение может выдаваться и при возникновении других обстоятельств, влияющих на качество теста.

При получении сообщения об ошибке, пробирки необходимо извлечь из прибора, инокулировать новые порции суспензии микобактерий в свежие пробирки и повторить исследование.

Заключение

В заключении следует обратить внимание на правила учета результатов исследований для использования в клинике, в особенности случаи расхождения результатов с данными полученными методом абсолютных концентраций. При получении сведений об отсутствии лекарственной чувствительности к отдельным ПТП, определяемым методом посева на жидкие питательные среды, следует руководствоваться следующим алгоритмом:

РАЗДЕЛ 1. Лекционные материалы