6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_Котловский_Ю_В_ред_

- 92 -

На исследование берут кровь, введя тонкую иглу в просвет вены в локтевом сгибе. Кровь собирают в пробирку, куда предварительно добавляют специальное вещество - антикоагулянт, которое препятствует свертыванию крови и обеспечивает сохранение интересующих нас клеток крови в виде суспензии в плазме.

КАКИЕ КЛЕТКИ И КАК ИССЛЕДУЮТ?

Внимание иммунологов привлекают белые клетки крови - лейкоциты, к которым относятся гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Наибольший интерес, с точки зрения иммунологов, представляют лимфоциты. Под микроскопом все лимфоциты выглядят одинаково, но по своим функциям они делятся на две популяции: Т-лимфоциты и В- лимфоциты. Т-лимфоциты получили свое название от органа "тимус", где происходит их созревание. Созревание В-лимфоцитов у человека происходит непосредственно в костном мозге. Т-лимфоциты участвуют в регуляции иммунного ответа, обеспечивают защиту, в основном, от вирусов, грибов, некоторых бактерий. В-лимфоциты после встречи с чужеродным антигеном превращаются в антителопродуцирующие плазматические клетки и обеспечивают защиту от бактерий и их токсинов. Поскольку функции Т- и В- лимфоцитов различны, необходим раздельный учет количества клеток каждой из этих популяций в крови. Такая возможность существует, благодаря различному строению их поверхностных мембран, в составе которых удается обнаружить определенные белки, характерные для отдельной популяции. Существует современный и надежный метод дифференцировки разных популяций и субпопуляций лейкоцитов крови. Для этого используют так называемые моноклональные антитела, то есть антитела, заранее полученные против отдельных белков (в рассматриваемом случае компонентов клеточных мембран лейкоцитов) и способные соединяться только с этими белками. Такие антитела снабжаются меткой, например флуорисцирующим красителем. Если каплю крови соединить с мечеными антителами против Т-клеточных белков, способность светиться приобретают только Т-лимфоциты. А для подсчета количества светящихся клеток в определенном объеме крови создан специальный прибор - флуоресцентный анализатор клеток, или проточный цитофлуориметр. Поток клеток проходит через тончайший капилляр, на который падает возбуждающий люминесценцию луч света. Каждая светящаяся клетка регистрируется специальным детектором в виде импульса испускаемого ею свечения. Прибор автоматически обрабатывает информацию и выдает результаты в виде гистограммы - графика распределения клеток с разной интенсивностью свечения. Используя широкий набор моноклональных антител, можно определить количественное содержание в крови не только Т- и В-лимфоцитов, но и субпопуляций Т- лимфоцитов: Т-хелперов (CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), - каждая из которых несет на клеточной мембране свой характерный "маркер" CD4 или CD8, выявляемый специфическими моноклональными антителами. Естественные киллеры - разновидность лимфоцитов, не относящихся ни к Т-, ни к В-лимфоцитам, тоже несут на поверхностной мембране свой маркер, так что их количество также поддается подсчету.

При каких заболеваниях необходимо делать иммунограмму, обращаться к иммунологу?

- кардиология: ревматизм, инфекционно-аллергический миокардит; -пульмонология: бронхиты хронические, часто повторяющиеся с единичными

пневмониями в анамнезе, бронхиты с единичными пневмониями и в сочетании с хронической инфекцией ЛОР-органов (синуситами, гнойным средним отитом), пневмонии рецидивирующие, хронические, непрерывно текущие, бронхопневмонии, плевропневмонии; бронхиты в сочетании с повышенной чувствительностью к ОРВИ с бронхоспастическим компонентом; астматический бронхит; атопическая бронхиальная астма; актиномикоз легких; частые до 5 раз в год ОРВИ; - отоларингология: флегмонозные ангины в сочетании с хроническим тонзиллитом,

перитонзиллярные абсцессы полости рта, аллергический (вазомоторный) ринит, ангина (аденоидит, ангина агранулоцитарная, ангина фолликулярная), синусит (гайморит,

- 93 -

фронтит), поллиноз, ангионевротический отек, отит средний (аллергический, инфекционный); -дерматология: бактериальные инфекции кожи (стрепто- и стафилодермии);

рецидивирующий фурункулез; грибковые инфекции кожи и слизистых (кандидоз); микозы; рецидивирующий герпес labialis чаще 2 раз в год; опоясывающий лишай; рецидивирующий опоясывающий герпес; атопический (аллергический) дерматит; нейродермит; вульгарная пузырчатка; пемфигоид; крапивница; экзема в сочетании с повышенной чувствительностью к ОРВИ; наличие инфекционного компонента кожноатопических проявлений; тяжелый атопический синдром; дискоидная эритематозная волчанка; системная красная волчанка; склеродермия; дерматомиозит; системные васкулиты; контагиозный моллюск; бородавки; остроконечные кондиломы; вялозаживающие раны; -офтальмология: симпатическая офтальмия, инфекционновоспалительные заболевания

глаз (факогенный увеит, герпес глаз, трахома, блефарит, блефароконъюктивит, иридоциклит, ирит, кератит, кератоиридоциклит, кератоконъюктивит, ретинит, склерит, циклит, эписклерит), аллергический конъюктивит; -хирургия: бактериальные инфекции подкожной клетчатки (абсцессы, флегмоны,

септические гранулемы), рецидивирующий парапроктит, повторные лимфадениты, лимфоаденопатии; -стоматология: афтозные, терапевтически резистентные стоматиты в сочетании с

повышенной чувствительностью к ОРВИ, молочница, стоматит герпетический; -гастроэнтерология: гастроэнтеропатии с хронической диареей, гельминтозы (анкилостомоз, аскаридоз, гименолепидоз, дифиллоботриоз, клонорхоз, некатороз, описторхоз, парагонимоз, стронгилоидоз, тениаринхоз, тениоз, трихинеллез, трихоцефалез, шистоматоз, энтеробиоз), дисбактериоз кишечника, кандидозы ЖКТ, неспецифический язвенный колит, аутоиммунный атрофический гастрит (гастрит типа А), первичный билиарный цирроз печени, аутоиммунный гепатит, криптогенный цирроз печени (некоторые случаи), аллергические заболевания ЖКТ (диарея аллергическая), - урология: урогенитальные инфекции, хронические пиелонефриты с частыми обострениями (без аномалии развития мочевыводящей системы); -нефрология: аутоиммунный гломерулонефрит, хроническая почечная недостаточность, нефротический синдром; -андрология: мужское бесплодие (некоторые случаи);

-артрология: ревматоидный артрит, артрит инфекционный; -гематология: идиопатическая лейкопения, аутоиммунная гранулоцитопения

(агранулоцитоз), идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная гемолитическая анемия, пернициозная анемия; -эндокринология: аутоиммунный тиреоидит (тиреоидит Хасимото), первичная микседема;

тиреотоксикоз, инсулинозависимый сахарный диабет с частыми инфекциями, локализованными абсцессами; ювенильный диабет; болезнь Аддисона; -неврология: рассеянный склероз, миастения гравис;

- гинекология: ранняя менопауза (некоторые случаи), генитальный герпес, бактериальный вагиноз (дисбактериоз влагалища), кандидоз влагалища; -общие симптомы и признаки: длительный субфебрилитет, лихорадка неясной этиологии,

аллергические реакции к пищевым продуктам, к лекарственным средствам, биопрепаратам, к домашней пыли, на укусы насекомых, частые инфекционные заболевания, сенсибилизация к пыльце сложноцветных, рецидивирующие оппортунистические инфекции внутренних органов, синдром хронической усталости, наличие тяжелой или многочисленной патологии.

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА

Неспецифические факторы резистентности организма принимают непосредственное участие вначале, в период развития и в конечной фазе иммунного ответа. В иммунный

- 94 -

ответ организма сначала включаются неспецифические, а затем специфические механизмы реактивности при инфекции, вакцинации и воспалительном процессе. Реактивность данной системы не дифференцирована по отношению к конкретному антигену и направлена против любых инфекционных и неинфекционных агентов. В системе неспецифической резистентности организма можно выделить процессы, которые

еерегулируют:

фагоцитоз;

лизоцим;

система комплемента;

цитокины.

Определение состояния неспецифической резистентности организма имеет важное значение в комплексной оценке иммунного статуса. От состояния неспецифических защитно-приспособительных механизмов зависит исход начальной стадии инфекционновоспалителыюго процесса. Резкое и длительное их угнетение — неблагоприятный прогностический признак.

3. Фагоцитоз

Фагоцитоз — поглощение клеткой крупных частиц, видимых в микроскоп (например, микроорганизмов, крупных вирусов, поврежденных тел клеток и т.д.). Процесс фагоцитоза можно подразделить на две фазы. В первой фазе частицы связываются на поверхности мембраны. Во второй фазе происходят собственно поглощение частицы и ее дальнейшее разрушение. Различают две основные группы клеток фагоцитов — мононуклеарные и полинуклеарные. Полинуклеарные нейтрофилы составляют первую линию зашиты от проникновения в организм разнообразных бактерий, грибов и простейших. Они уничтожают поврежденные и погибшие клетки, участвуют в процессе удаления старых эритроцитов и очистки раневой поверхности. Мононуклеарные фагоциты участвуют как в разрушении, так и в инициации и стимуляции фибробластических процессов. Они способствуют синтезу биологически активных веществ и формированию иммунного ответа (путем модификации антигенов и представления их лимфоцитам). Таким образом, клетки мононуклеарно-фагоцитарной системы играют важную роль в инициации иммунного ответа посредством захвата антигена, представления его Т-лимфоцитам и секреции интерлейкина-1 (основного активатора Т-лимфоцитов).

Изучение показателей фагоцитоза имеет значение в комплексном анализе и диагностике иммунодефицитных состояний: часто рецидивирующих гнойно-воспалительных процессов, длительно не заживающих ран, склонности к послеоперационным осложнениям. Исследование системы фагоцитоза помогает в диагностике вторичных иммунодефицитных состояний, вызванных лекарственной терапией. В связи с тем, что фагоциты участвуют в элиминации иммунных комплексов и активность фагоцитоза тесно связана с активностью компонентов комплемента, а именно СЗ, концентрацией IgGантител, наличием других онсонирующих факторов, исследование активности фагоцитоза играет важную роль в диагностике, оценке активности и эффективности терапии при ревматических заболеваниях, коллагенозах. Наиболее информативными для оценки активности фагоцитоза считают фагоцитарный индекс, количество активных фагоцитов и индекс завершенности фагоцитоза. О бактерицидной активности нейтрофилов судят по тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) или лизосомально-катионному тесту (ЛКТ)

Фагоцитарная активность нейтрофилов Параметры, характеризующие состояние фагоцитоза.

Фагоцитарное число: норма — 5—10 микробных частиц. Фагоцитарное число — среднее количество микробов, поглощенных одним нейтрофллом крови. Характеризует поглотительную способность нейтрофилов.

- 95 -

Фагоцитарная емкость крови (ФЕК): норма — 12,5—25•109 на 1 л крови. ФЕК — количество микроорганизмов, которое могут поглотить нейтрофилы 1 л крови.

Фагоцитарный показатель: норма — 65—95%. Фагоцитарный показатель — процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе.

Количество активных фагоцитов (КАФ): норма — 1,6—5,0•109 на 1 л крови.

КАФ — абсолютное число фагоцитирующих нейтрофилов в 1 л крови.

Индекс завершенности фагоцитоза: норма >1,0. Индекс завершенности фагоцитоза — переваривающая способность фагоцитов.

Фагоцитарная активность нейтрофилов обычно повышается в начале развития воспалительного процесса. Ее снижение ведет к хронизации воспалительного процесса и поддержанию аутоиммунного процесса, так как при этом нарушается функция разрушения и выведения иммунных комплексов из организма.

Заболевания и состояния, при которых изменяется фагоцитарная активность нейтрофилов, представлены в табл.

Спонтанный тест с НСТ в крови Величина спонтанною теста с НСТ в крови в норме: у взрослых число НСТ-

положительных нейтрофилов — до 10 %.

Спонтанный тест с НСТ (нитросиний тетразолий) позволяет оценить степень антигенной раздраженности неактивированных in vivo гранулоцитов крови. Он характеризует степень активации внутриклеточных антибактериальных систем. Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинего тетразолия в нерастворимый диформазан под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Н-оксидазной реакции, инициирующей процесс стимуляции фагоцита. Показатели НСТ-теста повышаются в начальном периоде острых бактериальных инфекций, тогда как при подостром и хроническом течении инфекционного процесса они снижаются. Санация организма от возбудителя сопровождается нормализацией показателя. Резкое снижение свидетельствует о декомпенсации противоинфекционной защиты и является прогностически неблагоприятным признаком.

- 96 -

Снижение спонтанного теста с НСТ характерно для хронизации воспалительного процесса, врожденных дефектов фагоцитарной системы, вторичных и первичных иммунодефицитов, СПИДа, злокачественных новообразований, тяжелых ожогов, травм, стрессов, недостаточности питания, лечения цитостатиками и иммунодепрессантами, облучения ионизирующей радиацией.

Повышение спонтанного теста с НСТ отмечается при антигенном раздражении вследствие бактериального воспаления (продромальный период, период острого проявления инфекции при нормальной активности фагоцитоза), хроническом гранулематозе, лейкоцитозе, усилении аитителозависимой цитотоксичности фагоцитов, аутоаллергических заболеваниях, аллергии.

Активированный тест с НСТ в крови Величина активированного теста с НСТ в крови в норме: у взрослых число

НСТ-положительных нейтрофилов — 40—80 %.

Активированный тест с нитросиним тетразолием позволяет оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов. Тест используют для выявления резервных возможностей внутриклеточных систем фагоцитов. При сохраненной внутриклеточной антибактериальной активности в фагоцитах резко возрастает число формазанположительных нейтрофилов после их стимуляции пирогеналом. Снижение показателей активированного НСТ-теста нейтрофилов ниже 40 % и моноцитов ниже 87 % свидетельствует о недостаточности фагоцитоза.

4.Иммунномоделирующая терапия – восстановление эффективного функционирования иммунной системы, приводящее к выздоравливанию больного. Основные принципы иммунномоделирующей терапии:

1.Подавление патогена или его элиминация.

2.Детоксикация организма.

3.Нормализация метаболической активности организма.

4.Стимуляция функционирования иммунной системы, чтобы помочь ей справиться с чужеродными агентами в тех случаях, когда она не в состоянии этого сделать самостоятельно в течение длительного времени.

5.Диагностика аллергии

Внастоящее время аллергическими заболеваниями страдает от 20 до 40% людей. Это аллергические риниты, конъюнктивиты, аллергическая бронхиальная астма, атопический дерматит. И заболеваемость неуклонно увеличивается. В основе аллергических болезней лежат иммунологически опосредованные реакции специфической повышенной чувствительности (гиперчувствительности) организма к аллергенам. Аллергические заболевания часто являются проявлением атопии. Это особая форма семейной предрасположенности к выработке аллергических антител (аллергенспецифического иммуноглобулина Е). В процессе эволюции они были выработаны для связывания распространенных в окружающей среде аллергенов -пыльцы растений, домашнего клеща, грибов, насекомых, белков животных и пр. Основной механизм этого типа реакции гиперчувствительности состоит в следующем: аллерген, попав в организм, индуцирует (вызывает) образование аллергических антител, принадлежащих к иммуноглобулину Е (IgE). Этот иммуноглобулин фиксируется на клетках воспаления. Создается специфический механизм "узнавания" повторно поступающего в организм аллергена. Повторно поступивший в организм аллерген перекрестно связывает между собой фиксированные на клетке IgE антитела и, соответственно, клеточные рецепторы этого иммуноглобулина. Перекрестное связывание поверхностных молекул IgE активирует тучные клетки, в результате чего из них секретируются медиаторы, которые действуют на другие клетки и ткани и быстро вызывают внешние проявления реакции. Это ранняя фаза, возникает в пределах нескольких минут после действия аллергена; сокращение гладкой мускулатуры, повышение сосудистой проницаемости, отек ткани,

- 97 -

раздражение периферических нервных окончаний, повышенная секреция слизи. Наряду с эффектами, возникающими в раннюю фазу аллергической реакции, отдельные медиаторы вызывают отсроченную реакцию. Она развивается через 6-8 ч после действия аллергена. В зависимости от того, в каком органе или ткани произойдет встреча аллергена с фиксированными на клетках воспаления IgE антителами, возникают характерные проявления, создающие клиническую картину аллергического заболевания. На конъюнктиве глаз развивается аллергический конъюнктивит, на слизистой носа - аллергический ринит, в бронхах - бронхиальная астма, в поверхностных слоях кожи - крапивница, в глубоких слоях дермы - отек Квинке и т.д. Если же в реакцию одновременно включается значительное число клеток аллергии, возникает тяжелая общая реакция - анафилактический шок. Основная цель диагностики при аллергических заболеваниях - определение аллергена или аллергенов, к которым имеется повышенная чувствительность пациента. Этой цели служит аллерген - специфическая диагностика, включающая получение анамнестических сведений, которые позволяют предположительно, а иногда, и достаточно точно выявить "виновный" аллерген. Решающим этапом аллерген-специфической диагностики является проведение диагностических проб, которые являются основой для проведения аллергенспецифического лечения и профилактики обострений заболевания. Кожные пробы. Их можно проводить только после 5-летнего возраста. Но и у взрослых, учитывая возможность тяжелых осложнений вплоть до анафилактического шока, а также сложность оценки результатов эти пробы допустимо проводить только в специальных аллергологических учреждениях под наблюдением врача-аллерголога! Иммунологические методы. Их преимущество заключается в полной безопасности для пациента. Особенно важно исследовать, наличие в крови общих IgE-антител, ответственных за развитие аллергии и специфических IgE - антител. Разумеется, результаты анализа должны быть всегда сопоставлены врачом аллергологом с клинической картиной заболевания. Только после этого может быть выбрана адекватная терапия.

Примечание: Аллерген - вещество, вызывающее развитие аллергической реакции. Аллерген отличается от антигена конечным результатом. Если введение вещества приводит к развитию аллергической реакции, то его называют аллергеном, если к развитию иммунной - антигеном. Последние представляют собою, главным образом, белки. Аллергические реакции могут вызывать вещества не только антигенной природы, но и вещества, не обладающие этими свойствами. К ним относятся многие микромолекулярные соединения, например лекарственные препараты, простые химические вещества (бром, йод, хром, никель и др.), а также более сложные продукты небелковой природы (некоторые микробные продукты, полисахариды и др.). Эти вещества называют гаптенами. При попадании в организм они не включают иммунных механизмов. Они становятся антигенами (аллергенами) только после соединения с белками тканей организма. При этом образуются комплексные антигены, которые и сенсибилизируют организм. Иммуноглобулин Е. В результате сложных механизмов после воздействия антигенов в организме увеличивается количество иммуноглобулинов Е. По данным разных авторов, концентрация общего IgE в крови значительно колеблется. Наименьшая его концентрация отмечена у новорожденных. С возрастом она постепенно увеличивается и примерно к 10 годам достигает уровня взрослых. У здоровых взрослых людей концентрация общего IgE в плазме крови составляет 30-60 КЕ/л. Клетки, продуцирующие IgE, относятся к долгоживущим. Полагают, что они находятся преимущественно в лимфоидной ткани слизистых оболочек и лимфатических узлах. Поэтому "шоковыми" органами являются, в первую очередь, органы дыхания, кишечник, конъюнктива глаза.

1. Диагностика аллергии

- 98 -

Диагностика аллергии на анализаторе Elecsus 2010 Roche Hitachi.

a)JgE общий - повышается при аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, экзема, ринит, паразиты)

Норма: дети до 1 года 3,5-4,0; взрослые 3,5-100МЕ/мл

b)JgE специфический - 88 видов аллергенов (пищевые, бытовые, растительные)

Для проведения обследования достаточно 10 мкл сыворотки для диагностики 1 аллергена. Обследование допустимо проводить в период рецидива и ремиссии и заболевания.

2. Диагностика аллергии к лекарственным препаратам, использующимся в лечении. Аллергические реакции на лекарственные препараты - это иммунологический ответ на препарат или его метаболиты, приводящий к развитию клинически значимых нежелательных реакций (отечность, сыпь, зуд и т.д.). Для этих реакций характерны следующие черты:

в их основе лежат иммунологические механизмы;

они возникают после контакта с лекарственным препаратом;

развиваются быстро, при повторной встрече с аллергеном.

Тест па пищевую непереносимость

Пищевая аллергия является одной из причин многих острых и хронических заболеваний. Пищевая аллергия трудно распознается. Множество людей имеет симптомы аллергии на наиболее часто употребляемые продукты. lgG-зависимая реакция (тип 111 аллергической реакции) часто встречаемая, редко диагностируемая и плохо отвечающая на лечение реакция. Симптомы пищевой аллергии развиваются как минимум через 2 часа, но чаще через несколько дней после приема определенных продуктов и пациент не может связать ее с каким-либо определенным продуктом. Кроме того, проявления аллергической реакции данного типа могут быть очень разнообразными, провоцируя развитие различных симптомов или заболеваний. Например, гастриты, целиакия, синдром раздраженного кишечника, воспалительные заболевания кишечника, депрессия, проблемы контроля веса, отеки, задержка жидкости, бронхиты, бронхиальная астма, головные боли, артриты, нарушения сна и многие другие заболевания могут быть обусловлены наличием пищевой аллергии.

Пациенты получают на руки документ с результатами анализа о наличии специфических антител (например, к антигенам молока) и полностью исключают продукт из своего рациона на длительное время. При полном исключении аллергенов концентрация аллерген - специфических иммуноглобулинов снижается, и постепенно тест становится отрицательным. Если в течение 3-6 месяцев полностью исключить употребление продуктов, вызывающих аллергическую реакцию замедленного типа, то, в большинстве случаев, удается в дальнейшем употреблять данные продукты 1 раз в 3-4 дня без