6 курс / Кардиология / Диагностика_инфекций,_передаваемых_половым_путём_Хворик_Д_Ф
.pdfТаблица 11 – Микроскопическое исследование нативного препарата
Название |
|
Описание |
|
|
|
Принцип |
Выявление воспалительных изменений в первичных |
|
|||
|
образцах, поиск и обнаружение T.vaginalis. |
||||
Материал для |
Отделяемое из уретры. |
|
|
|
|
исследования |
Отделяемое заднего свода влагалища. |
|
|
||
Необходимое |
1) бинокулярный |
микроскоп |
с |
возможностью |
|
оборудование |
увеличения до х1000 с обычным или темнопольным |
||||
и материалы |
конденсором; |
|
|
|
|
2)пипетки пластиковые или дозатор полуавтоматический с наконечниками;
3)перчатки медицинские;
4)емкости для сбора и обработки стекол;
5)предметные стекла;
6)покровные стекла;
7)маркер.
Реагенты |
- изотонический раствор хлорида натрия стерильный; |
|
- антисептические и дезинфицирующие средства, |
|
разрешенные к применению. |
Подготовка к |
Приготовление препарата: |
проведению |
На предметное стекло поместить каплю теплого (+18 – |
анализа |
22°С) изотонического раствора хлорида натрия |
|
стерильного. |
|
Поместить инструмент с исследуемым материалом на |
|
поверхность капли и перемешать содержимое. |
|
Взвесь накрыть покровным стеклом и микроскопировать |
|
при увеличении х100, х400 с опущенным конденсором |
|
или в темном поле зрения. |
Учет и оценка |
При увеличении микроскопа х100 оценивают: |
результатов |
- наличие и состояние клеток вагинального эпителия |
|
(эпителия уретры); |
|
- количество и морфологию лейкоцитов; |
|
- наличие и морфологию микрофлоры; |
|
- наличие T.vaginalis. |
|
При увеличении микроскопа х400 оценивают |
|
морфологию и движение T.vaginalis: размер T.vaginalis |
|
приблизительно равен размеру ядра эпителиальной |
|
клетки или сегментоядерного нейтрофила, форма |
|
грушевидная, овальная, реже – округлая, движения – |
|
толчкообразные, поступательные и вращательные за |
|
счет жгутиков и ундулирующей мембраны. Необходимо |
|
дифференцировать движение T.vaginalis от пассивного |
|
(броуновского) движения клеток во влажной среде. |
41
|
Критерием для лабораторного заключения о наличии |
||||||
|
T.vaginalis является обнаружение хотя бы одного |
||||||
|
организма с четко различимыми жгутиками. |
|
|
||||
|
T.vaginalis |
может |
быть |
обнаружена |
при |
||
|
общеклиническом исследовании осадка мочи. |
|
|||||
Заключение |
1. Подвижные |
организмы, |
сходные с |
T.vaginalis, |
|||
лабораторного |
обнаружены. |
|
|
|
|
|
|
исследования |
2. Подвижные организмы, сходные с T.vaginalis, не |
||||||
|
обнаружены. |
|
|
|
|
|
|
Контроль |
На преаналитическом этапе оценивается: |
|
|
||||
качества |
- взятие биологического материала в соответствии с |
||||||
|
требованиями, наличие материала в препарате, наличие |
||||||
|
в исследуемом материале клеток многослойного |
||||||
|
плоского эпителия; |
|
|
|
|
|
|
|
- выполнение требований хранения и доставки |
||||||
|
материала в лабораторию; наличие в препарате |
||||||
|
кристаллов свидетельствует о его подсыхании; |
|
|||||
|
- выполнение требований маркировки проб и |
||||||
|
соответствия |
маркировки |
|
пробы |
маркировке |
||
|
направления. |
|
|
|
|
|
|
|
Мероприятия аналитического этапа: |
|
|
||||
|
- соблюдение технологии приготовления нативного |
||||||
|
препарата; |
|
|
|
|
|
|
|
- учет результатов с контрольным материалом в |
||||||
|
соответствии с официально признанными критериями. |
||||||
|
Мероприятия постаналитического этапа: |
|
|
||||
|
- правильность |
внесения |
результатов |
в |
бланк |
||
|
исследования; |
|
|
|
|
|
|
|
- своевременное доведение информации до врача, |
||||||
|
назначившего исследование. |
|
|
|
|
||
Источники |
- нарушение техники взятия клинического материала; |
||||||
ошибок |
- использование холодного физиологического раствора; |
||||||
|
- нарушение условий транспортировки клинического |
||||||
|
материала в лабораторию (неоптимальная температура и |
||||||
|
высыхание образца); |
|
|
|
|
|
|
|
- неудовлетворительное |
техническое |
состояние |
||||
|
микроскопа; |
|
|
|
|
|
|
|
- нарушение методики проведения микроскопического |
||||||
|
анализа; |
|
|
|
|
|
|
|
- недостаточная квалификация персонала. |
|
|
42
Таблица 12 – Микроскопическое исследование окрашенного препарата
Название |
|
Описание |
|
|
|
Принцип |
Выявление воспалительных изменений в пробах, |
|
|||
|
поиск и обнаружение T.vaginalis. |
|
|
|
|
Материал для |
Отделяемое из уретры. |
|
|
|
|
исследования |
Отделяемое заднего свода влагалища. |
|
|
||
Необходимое |
1) бинокулярный |
микроскоп |
с |
возможность |
|
оборудование и |
увеличения до Ч1000; |
|
|
|
|
материалы |
2) пипетки пластиковые; |
|
|
|
3)песочные часы на 1 и 3 минуты или таймер;
4)приспособление для окраски мазков;
5)перчатки медицинские;
6)емкости для сбора и обработки стекол;
7)предметные стекла;
8)стеклянный стакан;
9)фильтровальная бумага;
10)маркер.
Реагенты |
1) иммерсионное масло; |
|
2) 1% водный раствор метиленового синего |
|
3) 1% спиртовой раствор метиленового синего (по |
|
Леффлеру); |
|
4) спирт этиловый 96°; |
|
5) антисептические и дезинфицирующие растворы. |
Подготовка |
к Перед окрашиванием препараты фиксировать 96% |
проведению |
этиловым спиртом (погружением на 1-2 мин.), при |
анализа |
окраске по Леффлеру предварительная фиксация не |
|
требуется. |
|
Зафиксированные препараты можно хранить при |
|
комнатной температуре в течение нескольких дней. |
|
Приготовление растворов красителей: |
|
- 1% водный раствор метиленового синего: растворить |
|
1 г метиленового синего в 100 мл дистиллированной |
|
воды, фильтровать через бумажный фильтр; |
|
- метиленовый синий (по Леффлеру) 1% спиртовой |
|
раствор метиленового синего: растворить 1 г |
|
метиленового синего в 100 мл 96% этилового спирта. |
Проведение |
Окраска мазков водным раствором метиленового |
анализа |
синего: на фиксированный препарат нанести 1% |
|
водный раствор метиленового синего на 1-2 мин. (в |
|
зависимости от толщины мазка). Тщательно смыть |
|
оставшийся краситель струей холодной воды. |
|
Препарат высушить на воздухе. Окраска мазков |
|
спиртовым раствором метиленового синего по |
|
Леффлеру: |
|
высушенный препарат опустить в стакан с 1% |
|
метиленовым синим по Леффлеру на 10-15 сек., |
43
Название |
|
|
Описание |
|
|
|
|
промыть погружением в другой стакан с |
|
||||
|
водопроводной водой, препарат высушить на воздухе. |
|||||
Учет и оценка |
Оценка мазков, окрашенных водным и спиртовым |
|
||||
результатов |
раствором метиленового синего: |
|
|
|||
|
- при микроскопии препарата видны: ядра клеток, |
|||||
|
окрашенные в синий цвет; цитоплазма, окрашенная в |
|||||
|
голубой цвет разной интенсивности; бактериальная |
|||||
|
микрофлора, окрашенная в синий цвет разной |
|||||
|
интенсивности; |
|
|
|
|
|
|
- T. vaginalis в препарате, окрашенном метиленовым |
|||||
|
синим, имеет разную форму: |
|
|
|
||
|
- грушевидную, овальную или округлую, контуры |
|||||
|
клетки хорошо выражены, ядро, как правило, |
|||||
|
расположено эксцентрично, овальное или вытянутое, |
|||||
|
имеет |
вид |
«сливовой |
косточки» |
окрашено |
|
|
интенсивнее, чем «пенистая» цитоплазма. |
|
|
|||
Заключение |
1. Подвижные организмы, сходные с T. vaginalis, |
|
||||
лабораторного |
обнаружены. |
|
|
|
|
|
исследования |
2. Подвижные организмы, сходные с T. vaginalis, не |
|||||
|
обнаружены. |
|
|
|
|
|
Контроль |
На преаналитическом этапе оценивается: |
|
|
|||
качества |
- взятие биологического материала в соответствии с |
|||||
|
требованиями; |
|
|
|
|
|
|
- выполнение требований хранения и доставки |
|||||
|
материала в лабораторию; |
|
|
|
||
|
- выполнение требований маркировки проб и |
|||||
|
соответствия |
маркировки |
пробы |
маркировке |
||
|
направления; |
|
|
|
|
|
|
контроль растворов красителей (внешнее состояние, |
|||||
|
срок годности), условия и сроки хранения; |
|
|
|||
|
- качество лабораторной посуды. |
|
|
|||
|
Мероприятия аналитического этапа: |
|
|
-соблюдение технологии окраски препарата. Проведение визуального анализа качества окрашивания препарата по Граму включает оценку интенсивности окрашивания клеток, при этом ядра эпителиальных клеток и лейкоцитов окрашены в фиолетовый цвет, а цитоплазма – в розовый цвет. Каждая новая серия реактивов для окрашивания по Граму должна быть проверена на качество при помощи грамположительных и грамотрицательных штаммов бактерий;
-учет результатов в соответствии с официально признанными критериями.
44
Название |
|
Описание |
|
|
|
|
|
Мероприятия постаналитического этапа: |
|||||
|
- правильность внесения результатов в бланк |
|||||
|
исследования; |
|
|
|
|
|
|
- своевременное доведение информации до врача, |
|||||
|
назначившего исследование. |
|
|
|
||
Источники |
— неудовлетворительное |
техническое |
состояние |
|||
ошибок |
микроскопа; |
|
|
|
|
|
|
— нарушение |
правил |
получения |
|
биологического |
|
|
материала для исследования; |
|
|
|
||
|
— использование загрязненной лабораторной посуды, |
|||||
|
старых, поцарапанных стекол; |
|
|
|
||
|
— нарушение методики приготовления препарата; |
|||||
|
— слишком толстый препарат; |
|
|
|
||
|
— нарушение методики окраски препаратов; |
|||||
|
— нарушение |
методики |
|
|
проведения |
|
|
микроскопического анализа. |
|
|
|
||
Устранение |
— поддержание |
микроскопа |
в |
|
надлежащем |
|
ошибок |
техническом состоянии; |
|
|
|
|
|
|
— следование данной инструкции; |
|
|
|
||
|
— при неправильной окраске надо повторить взятие |
|||||
|
материала и окраску мазка. |
|
|
|
Культуральные методы. Наиболее чувствительным и достоверным методом диагностики трихомониаза является выделение культуры трихомонад. Эффективность культуральной диагностики зависит от качества питательных сред и от условий культивирования трихомонад. За основу таких сред были приняты модификации среды Джонсона–Трасселя, содержащие: мясопептонный бульон, препараты печени, минеральные соли, сахара, сыворотку крови человека или животных, солянокислый протеин. В настоящее время в состав предложенных сред с высокими ростовыми свойствами входят мясо-пептонный бульон, препараты печени, минеральные соли, сахара, сыворотка крови человека или животных, солянокислый цистеин и др. Методы культивирования трихомонад хорошо известны и описаны в многочисленных изданиях [3].
Недостатком культуральной диагностики трихомониаза является ее длительность, что не соответствует требованиям обследования и терапии ИППП с целью быстрого излечения больного [18].
45
Методика культуральной диагностики УТ представлена в таблице 13 (Приложение №4 к Приказу МЗ РБ № 487 от 20 мая
2009 г.).
Таблица 23 – Методика культуральной диагностики УТ
Название |
|
Описание |
|
|
|
||
Принцип |
|
Выделение культуры T.vaginalis с использованием |
|
||||
|
|
специальных питательных сред с последующей |
|||||
|
|
идентификацией по морфологическим признакам. |
|||||
Биологический |
- отделяемое из уретры; |
|
|
|
|
||
материал |
для |
- отделяемое заднего свода влагалища; |
|
|
|||
исследования |
|
- центрифугат первой порции мочи. |
|
|
|||
Подготовка |
проб |
Дополнительная подготовка проб, полученных из |
|
||||
к исследованию |
уретры, цервикального канала, влагалища, не |
||||||
|
|
проводится. |
|
|
|
|
|
|
|
Первичную |
пробу |
первой |
порции |
мочи |
|
|
|
центрифугировать при скорости вращения ротора |
|||||
|
|
1000-1500 оборотов в минуту в течение 10 минут. |
|||||
|
|
Надосадочную |
жидкость |
удалить, |
осадок |
||
|
|
центрифугата подлежит дальнейшему исследованию. |
|||||
Оборудование, |
1) термостат на 36±1°С; |
|
|
|
|
||
инструменты |
и |
2) анаэростат или пакеты для создания анаэробных |
|||||
материалы |
|
условий культивирования; |
|
|
|
3)бактериологический анализатор;
4)спиртовка или газовая горелка;
5)световой микроскоп;
6)средства индивидуальной защиты персонала;
7)предметные стекла;
8)покровные стекла;
9)бактериологические петли;
10)пробирки или флаконы для среды;
11)маркер;
12)емкость для сбора отходов.
Реагенты |
Транспортные |
и |
питательные |
среды |
или |
|
|
коммерческие |
наборы |
для |
выделения |
и |
|
|
идентификации |
T.vaginalis, |
зарегистрированные в |
|||
|
установленном порядке на территории страны. |
|
||||
|
Вазелиновое масло. |
|
|
|
|
|
|
Красители для |
микроскопического исследования |
||||
|
окрашенных препаратов (1% водный или спиртовой |
|||||
|
раствор метиленового синего) |
|
|
46
Название |
|
|
Описание |
|
|
|
|
||
Подготовка |
к |
Культивирование T.vaginalis следует проводить во |
|
||||||
проведению |
флаконах или пробирках с количеством среды не |
||||||||
анализа |
|
менее 5 мл. Возможно использование коммерческих |
|||||||
|
|
тест-систем, не требующих специальной подготовки. |
|||||||
|
|
Хранение и приготовление сред осуществляют в |
|||||||
|
|
соответствии с инструкцией |
|
|
|
|
|||
Процедура |
|
Пробу биологического материала засевают с |
|
||||||
анализа |
|
помощью бактериологической петли в питательную |
|||||||
|
|
среду. При использовании транспортных сред посев |
|||||||
|
|
проводится тампоном, |
извлеченным из |
флакона |
|||||
|
|
(пробирки) с транспортной средой. Поверхность |
|||||||
|
|
среды заливают стерильным вазелиновым маслом |
|||||||
|
|
или используют другой способ для создания |
|||||||
|
|
анаэробных условий (анаэростат, тест-пакеты и др.). |
|||||||
|
|
Пробирки с посевами инкубируют при +37°С. |
|||||||
|
|
Просмотр посевов производят через 24 часа и далее |
|||||||
|
|
ежедневно. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
При использовании |
коммерческих |
культуральных |
|||||
|
|
систем |
руководствуются |
|
инструкцией |
||||
|
|
производителя. |
|
|
|
|
|
|
|
Учет и |
оценка |
Оценка |
вида |
колоний. |
T.vaginalis |
при |
|
||
результатов |
культивировании в жидкой питательной среде дает |
||||||||
|
|
придонный рост в виде плотного или рыхлого |
|||||||
|
|
беловатого осадка, напоминающего «облачко». |
|||||||
|
|
При отсутствии роста посевы инкубируют до 7 |
|||||||
|
|
суток, |
прежде |
чем |
окончательно |
выдать |
|||
|
|
отрицательный результат. В случае сильного |
|||||||
|
|
загрязнения посева может потребоваться повторный |
|||||||
|
|
пассаж (пересев) на питательную среду для |
|||||||
|
|
снижения контаминации. |
|
|
|
|
|
||
|
|
После каждого просмотра культуры необходимо |
|||||||
|
|
производить ее микроскопическое исследование. |
|||||||
|
|
Приготовление мазка из культуры и его |
|||||||
|
|
исследование и учет результатов производится в |
|||||||
|
|
соответствии с требованиями данной инструкции по |
|||||||
|
|
микроскопическому исследованию. |
|
|
|
||||
|
|
Форма |
лабораторного заключения |
культурального |
|||||
|
|
(бактериологического исследования): |
|
|
|
-T.vaginalis выделена;
-T.vaginalis не выделена.
47
Название |
|
Описание |
|
|
Контроль |
На преаналитическом этапе оценивается: |
|
||
качества |
взятие биологического материала в соответствии с |
|||
|
требованиями; |
|
|
|
|
выполнение требований хранения и доставки |
|||
|
материала в лабораторию; |
|
|
|
|
выполнение |
требований |
маркировки |
проб и |
|
соответствия |
маркировки |
пробы маркировке |
|
|
направления; |
|
|
|
|
контроль качества транспортных и питательных |
|||
|
сред (стерильность, ростовые свойства, способность |
|||
|
подавлять рост контаминирующей флоры, сроки и |
|||
|
условия хранения); |
|
|
|
|
проверка среды на стерильность осуществляется |
|||
|
путем инкубации образца среды в термостате при |
|||
|
+37°С в течение 48 часов; |
|
|
|
|
контроль ростовых свойств проводится путем |
|||
|
посева референс-штамма T.vaginalis; |
|
||
|
контроль среды на способность подавлять рост |
|||
|
контаминирующей флоры проводится путем посева |
|||
|
референс-штаммов Е.coli, |
S.epidermidis, |
N.sicca, |
|
|
С.albicans; |
|
|
|
|
контроль качества реагентов (внешнее состояние, |
|||
|
срок годности), условия и сроки хранения; |
|
||
|
качество лабораторной посуды; |
|
||
|
своевременность проведения метрологической |
|||
|
поверки средств измерения, используемых в |
|||
|
лаборатории. |
|
|
|
|
Мероприятия аналитического этапа: |
|
||
|
выполнение методики в соответствии с настоящей |
|||
|
инструкцией или инструкцией производителя тест- |
|||
|
систем; |
|
|
|
|
соблюдение технологии окраски в соответствии с |
|||
|
инструкцией; |
|
|
|
|
учет результатов в соответствии с официально |
|||
|
признанными критериями. |
|
|
|
|
Мероприятия постаналитического этапа: |
|
||
|
правильность |
внесения |
результатов |
в бланк |
|
исследования; |
|
|
|
|
своевременное доведение информации до врача, |
|||
|
назначившего исследование. |
|
|
|
|
|
|
|
|
48
Название |
Описание |
Источники |
Нарушение сроков и температурного режима при |
ошибок и пути их |
доставке материала. |
устранения |
Использование некачественных сред и реактивов. |
|
Неудовлетворительное состояние оборудования. |
|
Средства измерения, используемые для проведения |
|
исследования, должны иметь сертификат о |
|
государственной поверке. |
|
Нарушение методики посева и кратности просмотра. |
|
Проведение исследования должно выполняться в |
|
соответствии с требованиями настоящей инструкции |
|
и производителя тестсистем. |
Противопоказания |
Данный метод для широкого использования не |
для применения |
рекомендуется, предлагается для использования в |
метода |
научных целях и судебной практике. |
Серологические методы. Единственное достоинство данных методов – это возможность получения результата в день забора материала. В.И. Бедновой и соавт. были предприняты попытки использовать для идентификации трихомонад РИФ. Однако данную реакцию в широкой практике не применяют ввиду сложности, длительности постановки и невозможности стандартизировать антиген, а также субъективизма при оценке результата реакции [3].
Г.А. Дмитриев и соавт. (2005) указали на возможность использования ИФА для диагностики УТ. Выявление иммуноглобулинов класса G в сыворотке проводили с помощью тест-системы ЗАО «Вектор-бест» (Новосибирск). При этом получены данные о перспективности использования данного метода для диагностики трихомониаза[18].
Значительный интерес для выявления УТ представляет прямой ИФА с целью диагностики антигена в соскобах и в моче. Предварительные исследования продемонстрировали высокий процент положительных результатов ИФА на антиген по сравнению с другими методами диагностики при различных локализациях трихомонад: в уретре, цервикальном канале, влагалище. Однако говорить о широком практическом применении данных методик преждевременно [18].
49
Молекулярно-генетические методы. Чувствительность ПЦР при выявлении УТ составляет 97%, специфичность – 98% (Nascvimeto М.С. et al., 1998; Nath К. et al., 2000). К недостаткам ПЦР-анализа и ДНК-гибридизации в качестве отборочного теста при массовых скрининговых обследованиях относится дороговизна исследования и недостаточная информированность специалистов, к преимуществам – высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость, а также простота выполнения анализа и короткое время получения результата (Дмитриев Г.А. и соавт., 2007; Бочарова Е.Н. и соавт., 2001).
Методика молекулярно-биологической диагностики УТ представлена в таблице 14 (Приложение №5 к Приказу МЗ РБ № 487 от 20 мая 2009 г.).
Таблица 14 – Методика молекулярно-биологической диагностики УТ
Название |
|
|
|
Описание |
|
|
|
|
|
Принцип |
|
Диагностика T.vaginalis посредством обнаружения в |
|
||||||
|
|
образцах первичных проб нуклеиновых кислот |
|||||||
|
|
возбудителя. Основные принципы организации ПЦР – |
|||||||
|
|
лабораторий и проведения молекулярно-биологического |
|||||||
|
|
метода |
диагностики |
изложены |
в инструкции МЗ |
РБ |
|||
|
|
«Организация работ в лабораториях, использующих |
|||||||
|
|
метод |
полимеразной |
цепной |
реакции |
(ПЦР)» |
per. |
||
|
|
№ 090-1008 от 13.11.2008 г. |
|
|
|
|
|||
Биологический |
Соскоб эпителиальных клеток из уретры. |
|
|
|
|||||
материал |
для |
Отделяемое из заднего свода влагалища. |
|
|
|
||||
исследования |
Моча. |
|
|
|
|
|
|
||
Подготовка |
|
В случае хранения проб в морозильной камере |
|
||||||
проб |
к |
пробирки с образцами первичных проб следует |
|||||||
исследованию |
выдержать при комнатной температуре до их полного |
||||||||
|
|
оттаивания. Не допускается повторное замораживание – |
|||||||
|
|
оттаивание проб. |
|
|
|
|
|
||
Оборудование, |
1) |
ПЦР-боксы для проведения ПЦР-исследований (не |
|
||||||
инструменты и |
менее 2 шт.); |
|
|
|
|
|
|||
материалы |
|
2) |
холодильники на 2-8°С морозильной |
камерой |
(не |
||||
|
|
менее 3 шт.); |
|
|
|
|
|
3)твердотельные термостаты для микропробирок (не менее 2 шт.);
4)высокоскоростная (до 14000 об/мин) микроцентрифуга для пробирок типа «eppendorf»;
5)микроцентрифуги-вортексы для микропробирок (не
50